基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究

七叶树是七叶树科七叶树属高大乔木,集药用与观赏于一身。七叶树种子是其主要的药用部位,主要有效成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物七叶皂苷。为了解七叶树三萜化合物生物合成的分子基础,该研究采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序获得七叶树种子与花的转录组数据,并对其代谢途径相关基因进行挖掘;使用Trinity软件实现unigene的de novo拼接;并将转录组的测序结果运用KEGG数据库进行注释,从而预测七叶树三萜代谢的具体途径。结果显示七叶树转录组共有2个三萜代谢途径相关数据集,分别为萜类物质前体代谢途径(途径编号为ko00900)和倍半萜与三萜代谢途径(途径编号为ko00909),对应的基因分别有47,27条。进一步根据催化酶与活性产物的总结比较分析发现萜类物质前体代谢途径相关酶共有8种,三萜代谢途径相关酶有3种。该研究首次在七叶树中解析出5条与三萜环化酶对应的基因,它们可能参与β-香树精合成进而形成七叶皂苷。通过种子与花的转录组表达差异分析显示,ko00900和ko00909途径相关的差异基因有33个;相对于花器官,种子中有17个unigenes表达量上调,16个unigenes表达量下调。该研究运用qRT-PCR实验对SQE(Unigene25806),HMGS(Unigene36710),β-AS(Unigene33291) 3个差异显著的关键酶基因的表达进行了试验验证,实验结果qRT-PCR结果与转录组数据一致。该研究所发现的七叶树的三萜皂苷合成相关候选基因能对七叶树三萜代谢合成与调控方面提供理论依据。     

艾纳香黄酮类物质生物合成途径分析

为深入了解艾纳香中黄酮类物质的生物合成途径,提高艾纳香黄酮类活性物质的生物合成量,该课题基于艾纳香的转录组数据,将艾纳香的转录组测序结果同KEGG数据库中其他多种高等植物黄酮类物质生物合成途径的研究结论进行比对,预测出了艾纳香中黄酮类物质可能的代谢途径。研究结果表明,艾纳香在KEGG数据库中比对上2条黄酮类代谢通路,分别是:类黄酮生物合成途径,KEGG编号为ko00941,艾纳香转录组信息中有32条基因与该途径相关;黄酮和黄酮醇的生物合成,KEGG编号为ko00944,艾纳香转录组信息中有12条基因与该途径相关。艾纳香中黄酮类物质的生物合成主要与ko00941途径相关。艾纳香中黄酮类物质的生物合成途径与其他物种的高等植物相似,催化黄酮类物质生物合成的关键酶很可能也是CHS与查耳酮异构酶。艾纳香素是艾纳香中重要的药理活性物质,HCT与艾纳香素的生物合成密切相关。     

乌头萜类生物合成代谢的转录组学分析

目的:对乌头的6个器官组织,主根、侧根、茎、叶、花、果实进行转录组测序分析,以研究参与其萜类次级代谢生物合成相关基因的表达谱,挖掘其功能基因。方法:采用Illumina Hi Seq 2500平台测序、组装得unigenes,与公共数据库NR,Swiss-Prot,GO,COG,KOG,KEGG比对、注释以获得差异基因,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证参与萜类次级代谢生物合成的关键基因。结果:本研究共获得156 967 635条Clean Reads(28 254 174 300 bp),经序列合并拼接后获得103 337个unigenes,通过核苷酸和蛋白序列等方面的同源性分析,表明其中37.31%(38 554个unigenes)与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性,通过功能分类研究和代谢途径分析(KEGG)获得参与萜类合成158个unigenes(编码5个关键酶)。结论:这些发现的基因将为乌头萜类化合物的生物合成途径及分子机制提供基础数据。     

基于转录组测序挖掘国槐花蕾黄酮类物质生物合成相关基因

为研究国槐黄酮类物质的生物合成途径,利用高通量测序技术对国槐花蕾进行转录组测序,经Trinity软件组装获得113 907条unigenes,平均长度803 bp,其中72 752条unigenes在数据库获得注释信息,共搜索到38 891个SSR位点。通过代谢通路分析,发现国槐转录组中有135个unigenes参与黄酮类生物合成,有959条unigene参与其他次生代谢途径。进一步分析参与国槐芦丁生物合成相关基因,发现有24个与CHS相关,有52个与FLS相关,有11个与UFGT相关。国槐转录组数据的获得为研究国槐黄酮类物质生物合成途径奠定了基础,也为槐米药材品质的形成提供理论依据。     

金荞麦黄酮生物合成途径分析及关键酶基因鉴定

为了丰富金荞麦Fagopyrum dibotrys属植物的转录组数据,解析参与黄酮生物合成途径的关键酶基因,挖掘其功能基因,该研究利用BGISEQ-500测序平台对金荞麦的根状茎、根、花、叶和茎进行转录组测序,经过de novo从头组装转录本,共产生了205 619条unigenes, 132 372条获得7个公共数据库功能注释。其中81 327条unigenes比对注释到GO数据库,大部分unigenes注释在细胞过程、生物调控、结合和催化活性,86 922条unigenes富集在136个KEGG代谢途径,鉴定了82条unigenes参与编码黄酮类生物合成10个关键代谢酶。对金荞麦根状茎与根、花、叶和茎的差异表达基因(DEGs)进行分析,获得了27 962条共表达DEGs,有23 515条根状茎组织特异性表达DEGs富集132条KEGG代谢途径,而13条unigenes显著富集在黄酮和黄酮醇生物合成。此外,分析鉴定了3 427条unigenes参与编码60个转录因子(TFs)家族,有4条bHLH TFs富集在黄酮生物合成。该研究丰富了金荞麦属植物的转录组数据库,为植物黄酮生物合成关键酶的解析提供了参考,有助于从基因水平上进一步研究金荞麦黄酮生物合成关键酶的功能和调控机制。     

苗药八爪金龙转录组测序与次生代谢产物合成相关基因的挖掘

目的对八爪金龙根进行转录组测序,挖掘次生代谢合成相关基因,探索八爪金龙次生代谢产物生物合成的分子基础。方法采用IlluminaHi Seq4000高通量测序技术,对八爪金龙根进行转录组测序。使用Trinity软件对获得的Unigenes数据进行过滤组装,运用KEGG数据库对Unigenes进行注释。结果共获得52249条Unigenes,其中31391条被公共数据库成功注释,1507条Unigenes被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与八爪金龙苯丙素生物合成的Unigenes共有126条,参与萜类化合物骨架生物合成的Unigenes数量为73条,参与黄酮类化合物生物合成Unigenes有58条,参与次生代谢后修饰的Unigenes共有253条。筛选出9条Unigenes编码4个与八爪金龙香豆素生物合成的关键酶,23条Unigenes编码8个与黄酮生物合成的关键酶,39条Unigenes编码19个与萜类生物合成的关键酶,140条CYP450基因和113条UGT基因可能参与次生代谢物的修饰。微卫星识别软件(microsatellite identification tool,MISA)分析发现八爪金龙转录组包含17 400个简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)。结论通过高通量转录组测序,初步揭示了参与八爪金龙次生代谢产物合成相关的基因,为进一步研究八爪金龙次生代谢产物合成途径关键酶的功能及其调控机制奠定了基础。     

基于RNA-seq的银线草转录组分析

目的获得银线草Chloranthusjaponicus根茎转录组信息特征。方法用高通量测序平台IlluminaHiSeq TM2000150PE进行银线草根茎转录组测序分析。结果转录组测序共获得68458750条高质量序列(cleanreads),Trinitydenovo组装获得56 096个unigenes,平均长度801 nt。BLAST分析显示分别有25 773(45.94%)、17 801(31.73%)、16 082(28.67%)、9649(17.20%)个unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类40分支,涉及131个KEGG标准代谢通路,其中包括16个次生代谢标准通路。进一步分析获得170个基因参与单萜、二萜、倍半萜、三萜等萜类化合物生物合成通路。同时,转录组预测编码蛋白框序列1 887个;高等植物转录因子54个家族。借助MISA软件发现8 987个简单重复序列(SSRs),二碱基重复SSRs数量最丰富,有5 948个,出现频率为66.2%,五碱基重复SSRs相对较少,占1.3%。结论基于RNA-seq分析获得银线草根茎转录组信息特征及萜类合成代谢通路关键基因,为后期银线草活性成分次生代谢途径解析及调控研究奠定基础。     

基于转录组测序的山茱萸次生代谢生物合成相关基因的挖掘

为探讨山茱萸中环烯醚萜等次生代谢产物合成的遗传基础,采用新一代高通量测序技术对其果实进行转录组测序,共获得得96 032条unigenes,平均长度590.53 bp;其中共有35 478条unigene能被NR,Swissprot,COG,GO,KOG,Pfam和KEGG等7个公共数据库注释。通过对注释所得的unigene进行KEGG代谢通路的分析发现,共有84个unigene与环烯醚萜类成分的生物合成有关;487条unigene参与山茱萸其他次生代谢相关物质代谢调控。研究发现,共有153条unigene参与山茱萸次生代谢产物的氧化/羟基化;72条unigene参与次生代谢产物的糖基化。该研究首次对山茱萸转录组进行了分析,并获得了山茱萸环烯醚萜类等次生代谢生物合成相关的候选基因,为山茱萸的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后续探讨候选基因的功能奠定了基础。     

药用植物冬凌草高通量转录组测序与分析

目的:得到冬凌草高通量转录组数据,为挖掘冬凌草二萜类生物合成途径关键基因,研究冬凌草ESTSSR分子标记提供数据来源。方法:利用Illumina Hi Seq 4000高通量测序技术,采用Trinity的方法从头组装、序列拼接和去冗余处理;基于BLAST完成Unigene编码蛋白NR功能注释、GO分类、KEGG代谢通路注释和分类、功能基因挖掘,SSR分子标记挖掘。结果:获得冬凌草叶与茎两种不同组织共12 GB转录组数据,得到3 7961个Unigene基因,平均长度1063 bp;得到冬凌草叶和茎转录组有60条unigenes参与萜类化合物骨架合成、6条unigene参与各种萜类化合物合成,有26条unigene参与二萜化合物合成途径,叶与茎两种组织中有差异表达的基因4565个,其中在茎中表达较高的为1668个,在叶中表达较高的有2697个,与二萜类化合物合成相关的差异表达基因有15个。结论:本研究为冬凌草二萜化合物生物合成途径中关键基因的挖掘和分子育种提供了数据信息,为深入研究冬凌草中冬凌草甲素等有效成分的生物合成途径及其调控机制提供基础。     

款冬叶不同发育阶段的转录组学分析

目的比较不同生长时期款冬叶中苯丙素类成分生物合成相关基因的表达,推测苯丙素类成分的最佳合成积累时期,为款冬叶资源的合理利用提供科学依据。方法利用Illumina Hi Seq2500测序技术对不同时期的款冬叶进行转录组测序,获得转录组数据后进行基因功能注释等生物信息学分析,对苯丙素类生物合成相关基因在不同时期的表达进行比较。结果通过转录组测序技术获得46 793个Unigenes,平均长度为952.144 8 bp,其中有4 774个可以被NR、Swiss-Prot、eggNOG、GO、KEGG等公共数据库共同注释。对注释得到的Unigenes进行KEGG代谢通路分析,结果显示款冬叶转录组中有144条Unigenes参与萜类、黄酮类和苯丙素类生物合成,其中萜类65条,苯丙素类64条,黄酮类15条。进一步对参与苯丙素类生物合成相关基因进行动态比较,发现其关键酶PAL、4CL、HCT、CCoAOMT等在9月的表达量最高,即苯丙素类成分在9月的生物合成量可能最高。结论为苯丙素类成分的生物合成途径及调控分析奠定了基础,也为款冬叶资源的开发利用奠定了科学依据。     

茜草转录组分析及其蒽醌类化合物合成相关基因的挖掘

目的获得茜草Rubia cordifolia转录组学信息及挖掘其蒽醌类化合物生物合成的关键酶基因,为茜草的功能基因克隆与分析提供参考。方法采用Illunima Hiseq TM 2000 150PE高通量测序技术对茜草进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的de novo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析和蛋白功能注释等。结果最终获得7.3 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 66 646条,平均长度为1 424 bp,所有Unigene能被NCBI nonredundant protein sequences(NR)、NCBI nucleotide sequences(NT)、kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)、A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot)、gene ontology(GO)、eu Karyotic ortholog groups(KOG)和protein family(Pfam)数据库所注释,注释成功率100%,找到与茜草蒽醌类化合物生物合成相关的基因64条。结论首次对茜草转录组进行了分析,并获得了茜草蒽醌类化合物生物合成相关的候选基因,为茜草的分子生物学研究提供了丰富的数据资源,也为后期开展茜草蒽醌类化合物次生代谢途径解析奠定了基础。     

基于高通量测序的不同生态环境东方泽泻块茎转录组分析

目的 探索不同生态环境对东方泽泻生理活动及其药效成分原萜烷型三萜生物合成调控的分子基础。方法 通过Illumina HiSeq测序平台获取种植于福建和四川的东方泽泻块茎转录组数据并进行功能注释,基于|log₂FC|>0.58（FC为差异倍数）、P<0.05的筛选条件获得差异表达基因。结果 转录组测序共获得50 652条unigenes,有22 689条unigenes注释到京都基因与基因组百科全书（KEGG）、NR、SwissProt、COG、基因本体（GO）和Pfam数据库。从福建和四川2种环境生长的东方泽泻之间筛选到3878条差异表达基因,其中2082条在福建东方泽泻中上调表达,1796条在四川东方泽泻中上调表达,差异基因主要参与植物防御反应、光合作用、淀粉和蔗糖代谢、萜类生物合成等生理活动,包括5个原萜烷型三萜生物合成通路上的关键酶基因。此外,东方泽泻移栽四川后,与三萜生物合成相关的转录因子和细胞色素P450（CYP450）基因表达也发生了显著变化。结论 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了不同生态环境下东方泽泻转录组信息特征,为阐明生态环境对东方泽泻原萜烷型三萜生物合成的调控机制提供参考。     

杜仲愈伤组织转录组分析及其类黄酮合成相关基因的qRT-PCR分析

目的分析光、暗培养的杜仲愈伤组织转录组测序结果,验证杜仲愈伤组织转录组测序结果中与类黄酮合成相关基因的表达水平。方法利用Illumina Hi SeqTM 2500测序平台对光暗培养的2种杜仲愈伤组织进行转录组高通量测序,利用Trinity软件对测序结果进行De novo组装,使用BLAST软件将Unigenes序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam等数据库比对,利用FPKM值估算基因表达丰度,利用qRT-PCR验证与类黄酮合成相关基因的表达水平。结果杜仲愈伤组织转录组测序共获得13.00 Gbp的clean data。De novo组装后共获得62 030条Unigenes,平均长度为736.40 bp。使用BLAST软件将Unigenes序列与相关数据库比对,共获得25 417条Unigenes的注释结果。其中,25 167条Unigenes注释到Nr。4 794条Unigenes和它们相关的酶(enzyme commission numbers)注释到82条KEGG通路。共获得差异表达基因1 986条。在白光(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)培养的愈伤组织中,有1 139条基因表达上调,847条基因表达下调。在KEGG富集分析中发现,有7个Unigenes与类黄酮合成相关,其中有6个Unigenes在白光培养的杜仲愈伤组织中上调表达,它们编码的酶分别为查耳酮异构酶(EC 5.5.1.6,chalcone isomerase,CHI),查耳酮合成酶(EC 2.3.1.74,chalcome synthase,CHS),类黄酮3′-羟化酶(EC 1.14.13.21,flavonoid3′-monooxygenase,F3’H),反肉桂酸4-单加氧酶(EC 1.14.13.11,trans-cinnamate 4-monooxygenase,CYP),黄酮醇合成酶(EC 1.14.11.23,flavonol synthase,FLS),莽草酸邻羟基肉桂转移酶(EC 2.3.1.133,shikimate-O-hydroxycinnamoyl transferase,HQT)。1个Unigene下调表达,它编码的酶为无色花青素加氧酶(EC 1.14.11.19,leucocyanidin oxygenase,LDOX)。qRT-PCR分析表明,与类黄酮合成相关的7个Unigenes的表达情况与转录组测序分析结果是一致的。结论白光条件(光强为12 000 lx,16 h光照,8 h黑暗)可以促进类黄酮代谢途径中相关化合物的积累。     

白鲜根转录组高通量测序与数据分析

目的获得白鲜Dictamnus dasycarpus根转录组信息特征。方法以白鲜根为研究对象,采用Illumina HiSeq TM 2000150PE进行高通量转录组测序并进行数据分析。结果转录组测序共获得69 643 286条高质量序列(clean reads),Trinity denovo组装获得49 050条unigenes,平均长度841 nt。BLAST分析显示分别有31 636(64.49%)、22 367(45.60%)、19 246(39.23%)、12 595(25.68%)条unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类42分支,涉及132个KEGG标准代谢通路,其中包括18个次生代谢标准通路。进一步分析获得90个基因参与多种生物碱生物合成通路。蛋白编码框序列1 908个,高等植物转录因子55个家族;借助MISA软件发现4 579个SSRs,三碱基重复最丰富,有2 021个,出现频率为44.1%;五碱基重复SSRs仅占3.5%。结论利用高通量测序技术获得白鲜根转录组信息特征,为后期白鲜基因功能鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定基础。     

基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

刺五加转录组和差异性表达分析

目的获得刺五加Eleutherococcus senticosus转录组数据库和差异表达基因。方法采用皂苷高含量组和低含量组2个样本作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina Hi Seq 4000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得8.34 Gb数据,拼接得到77 087条Unigenes,与5个基因数据库进行比对,可归类于55个Geneontology(GO)分类中,涉及到116个KEGG标准代谢通路。通过差异性分析发现,差异性表达基因共530条,其中上调基因占42.08%,下调基因占57.92%,相差较大。进行GO和Pathway富集,得到408个GO注释和40个代谢通路。结论对刺五加转录组进行拼接、组装和功能注释,得到大量转录本信息,为刺五加分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据库资源。     

夏枯草的转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

目的获得夏枯草转录组信息,探索夏枯草次生代谢产物生物合成的分子基础。方法利用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术对夏枯草果穗、茎和叶等部位进行转录组测序,经Trinity软件组装后获得Unigene,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得77 863条Unigene,平均长度为716.72 nt。通过与NR、Swiss-Prot、COG等7个公共数据库进行BLAST比对,共有41 367个Unigene获得注释,注释率为53.13%。在KEGG数据库中,有1 406条Unigene被注释到次生代谢产物合成。通过对转录组数据深入挖掘发现,参与夏枯草三萜类骨架合成的Unigene共有60个,参与酚酸类合成的Unigene共有24个,参与次生代谢后修饰的Unigene共有259个,参与其他次生代谢合成的Unigene共有118个。结论夏枯草转录组数据为探索夏枯草次生代谢产物的生物合成机制提供了重要的资源,也为利用代谢工程增加夏枯草中重要次生代谢产物含量提供了基础信息。