人眼小梁细胞的体外培养与细胞骨架和细胞连接的研究

目的建立体外培养的人小梁(human trabecular meshwork,HTM)细胞,并观察小梁细胞细胞骨架与细胞连接的形态学特征。方法体外培养的HTM细胞传代后,免疫组化方法鉴定,电镜观察小梁细胞的超微结构,激光共聚焦显微镜观察actin、vinculin、β-catenin的表达。结果通过光镜、透射电镜、扫描电镜和免疫组化的方法证实体外培养的细胞为人眼小梁细胞。人眼小梁细胞的细胞骨架与细胞连接丰富。结论体外培养的小梁细胞细胞骨架结构明显,证明该细胞有收缩能力;β-连接素与纽蛋白着染明显,说明体外培养的小梁细胞,其细胞与细胞间、细胞与细胞基质间的连接仍具有活体小梁细胞的特性。     

体外培养的牛眼小梁细胞及微管微丝的形态学观察

目的 :初步观察体外培养的牛眼小梁细胞 (tra becularmeshworkcells,TMcell)及微管微丝的形态 ,为进一步探讨原发性开角型青光眼 (primaryopen angleglaucoma,POAG)的发病机制提供理论依据。方法 :①TM的体外培养 ,收稿日期 :2 0 0 1-11-19;修回日期 :2 0 0 2 -0 3 -2 0作者简介 :沈凤梅 (1964 -) ,女 ,山东人 ,医学硕士。通信作者 :沈凤梅 (E -mail:wanglgu @pub .xaonline .com)。应用免疫组化方法 (神经原特异性烯醇化酶 ,Ⅷ因子相关抗原染色 )进行细胞鉴定。用光学及透射电子显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察。②免疫组化法肌动蛋白(actin)、微管蛋白 α(tubulin α)染色。结果 :①TM细胞培养成功 ,以上皮型为主。②小梁细胞内富含微丝 ,与细胞长轴平行 ,并密集于细胞的周边部 ;微管以核周为主。结论 :牛眼小梁细胞体外培养技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术。小梁细胞富含微管微丝 ,在细胞的多种功能中发挥作用     

人眼小梁细胞体外培养,冻存与复苏

目的:建立人小梁细胞体外培养及对其进行冻存、复苏研究。方法:应用组织块培养方法进行人小梁细胞体外培养,将第3代的小梁细胞冻存,冻存1周、2周、1月、2月后细胞给予复苏,观察复苏后细胞的生长情况。结果:人眼小梁细胞体外培养成功。冻存的小梁细胞复苏成功,所有复苏率超过90％。结论:人眼小梁细胞体外培养及冻存复苏成功,为以后构建小梁细胞的cDNA文库,为筛选青光眼发病的相关基因提供有利的实验基础。眼科学报1998;14:73—75。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞微管及微丝动力学影响的研究

目的 研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞骨架的动力学影响,探讨AngⅡ对房水的调节作用及在青光眼发病机制中的意义。方法 （1）牛眼小梁细胞的体外培养,应用免疫组化方法（NSE,Ⅷ因子相关抗原染色）细胞鉴定,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;（2）以含不同浓度AngⅡ-的培养液孵育小梁细胞12-24h,（终浓度分别是10^-5、10^-6、10^-7mol.L^-1)。免疫组化法（SABC）对α-smooth-actin、tubulin-α染色,结果以计算机图像分析系统分析,并统计学检验。结果 牛眼小梁细胞培养成功,成活率80%——100%,上皮型为主,AngⅡ产生明显的细胞收缩效应,actin是收缩的主要效应器。结论 体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术,AngⅡ可以引起小梁细胞的浓度依赖性的收缩,提示Ang可能是房水排出途径的调节姻子之一,对眼压及青光眼的发生发展有一定的影响。     

嘌呤受体P2X7在人眼小梁网细胞上的表达及分布

目的　探讨嘌呤受体Ｐ２Ｘ７在体外培养正常人眼小梁网细胞上的表达及分布。方法　体外培养、鉴定正常人眼小梁网细胞,利用ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和免疫荧光法分别检测正常人眼小梁网细胞上Ｐ２Ｘ７受体ｍＲＮＡ和蛋白的表达情况及受体蛋白的主要分布部位。结果　光镜下观察原代培养的细胞具有人眼小梁网细胞的典型形态;免疫组织化学方法检测结果表明,培养的细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白、神经元特异性烯醇化酶及波形蛋白染色阳性,第Ⅷ因子染色阴性,鉴定为人眼小梁网细胞;ＲＴ－ＰＣＲ扩增到了Ｐ２Ｘ７ｍＲＮＡ１５２ｂｐ大小的基因片段,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ得到了相对分子质量约为７４０００的Ｐ２Ｘ７的蛋白条带,免疫荧光法证实Ｐ２Ｘ７受体在小梁网细胞膜、细胞质及细胞核内均有广泛分布。结论　人眼小梁网细胞上有Ｐ２Ｘ７受体表达,其在细胞内分布广泛。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞^3H胸腺核苷酸掺入率及胶原合成的影响

目的观测血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养的牛眼小梁细胞(bovine trabecularmeshwork cells,TM cell)3H胸腺核苷酸(3H-thymidine,3H-TdR)掺入率及胶原合成的影响,探讨原发性青光眼的发病机制.方法(1)牛眼小梁细胞的体外培养应用免疫组化方法(neuronal specific enolas,NSE,Ⅷ因子相关抗原染色)、细胞鉴定、光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察;(2)AngⅡ(1×10-7mol@L-1及1×10-8mol@L-1)以及其Ⅰ型受体(angiotensin receptor type I,AT1)拮抗剂孵育TM细胞,采用检测3H-TdR掺入率的方法了解细胞增殖状态,并用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量,间接推导胶原含量.结果牛眼小梁细胞培养成功,以上皮型为主.AngⅡ明显地增加了牛眼小梁细胞的3H-TdR摄入率,同时培养液中的羟脯氨酸含量亦相应增高.结论体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术.AngⅡ可以诱导体外培养的牛眼小梁细胞的细胞增殖率升高,同时促使胶原合成增强.AT1受体拮抗剂可以部分阻断此促增殖效应.眼科学报2001;17209-212.     

人眼小梁细胞体外培养与细胞鉴定

建立人眼小梁细胞体外培养方法和确定该细胞的鉴定要点。方法：小梁网和我巩膜组织来源于除眼部疾患以外各种原因死亡的６岁以下儿童，在２４小时内取材的３４人６８只正常眼球。组织块原代培养和细胞传代培养。用光镜和电镜观察培养细胞，用免疫组织细胞化学Ｓ－Ｐ法染色培养细胞的细胞外基质包括纤粘连蛋白，层粘连蛋白和Ⅳ型胶原。     

大麻素对牛眼小梁细胞增殖、粘附和迁移的影响

目的:通过研究内源性大麻素物质(anandamine,AEA),对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、黏附以及迁移功能的影响,探讨AEA降低眼压的机制。方法:对牛眼小梁细胞进行体外原代培养及传代培养,应用免疫组化的方法(NES,Ⅷ因子相关抗原染色)鉴定细胞,化学及透射电镜观察。对3代牛眼小梁细胞分别以含AEA10,1,0.1,0μmol/L DMEM(含100ml/L小牛血清)培养液进行干预,分别于24,2h,2h后用MTT法计数细胞,再利用计算机统计软件进行数据分析,观察其对牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能的影响。结果:内源性大麻素,在一定浓度范围内,对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能均有较为明显的抑制作用(P<0.05)。结论:由此,可以了解到AEA可能是通过影响小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能来改变房水流出途径的阻力,而降低眼内压。     

人眼虹膜色素上皮细胞体外培养、冻存与复苏

目的：建立人眼虹膜色素上皮细胞体外培养并对其进行冻存与复苏。方法：直接刮取虹膜色素上皮细胞组织碎屑进行培养,光镜观察生长特性及形态特点,透射电镜观察其超微结构。根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集细胞进行液氮冻存,至少2个月后进行复苏。结果：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养成功,原代细胞在光镜下呈多角形单层生长,胞浆内有丰富的色素颗粒;电镜下见胞浆富含色素、细胞器丰富、细胞膜有明显微绒毛、微丝、相监细胞之间可见桥粒连接。共冻存6批细胞,进行4次复苏实验均成功,每镒复苏细胞存活为90％。结论：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养的建立及冻存、复苏的成功,为研究某些疾病提供有利的基础。     

消化法牛眼小梁细胞的体外培养

目的 探讨用消化培养法体外培养牛眼小梁细胞，为进一步研究原发性开角型青光眼(POAG)提供实验材料。方法 0．25％胰蛋白酶、0．3％胶原酶等量混合行牛眼小梁细胞的原代培养和传代实验。结果 成功培养出性状良好的牛眼小梁细胞。结论 消化法培养牛眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞，是值得提倡的培养方法。     

Culture of human trabecular meshwork cells and the cell characteristics of immunohistochemical studies

OBJECTIVE: To look for better cultural methods in order to obtain numerous human trabecular cells in vitro for glaucoma experimental studies, and describe the immunohistochemical characteristics of the cells. METHOD: Human trabecular meshwork cells were cultured, then 4 monoclonal antibodies were used for immunohistochemical stains of the cultured cells. RESULTS: At the primary period, the growth of human trabecular cells was obviously slower than that of cows and pigs. The immunohistochemical stains showed that the cells presented positive reactions to neuronal specific enolase (NSE) and vimentin and negative reactions to factor VIII related antigen (VIIIR:Ag) and desmin. CONCLUSIONS: The culture of human trabecular meshwork cells in vitro needs more careful and better cultural conditions. The cells originally are derived from embryonic neural crest, not from mesodermal endothelium of blood vessels. There is middle filament vimentin and no desmin in the cells.     

The Study on Culture and Ultrastructure of Glaucomatous Trabecular Cells in Vitro

Purpose : To establish the culture system of human glaucomatous trabecular cells in vitro and study their ultrastructures.Methods : The trabecular specimens from trabeculectomy were cultured in vitro and passaged 3 times, then identified. Moreover, the glaucomatous cells were observed with electron microscope while compared with the normal ones.Result: Cultured human glaucomatous trabecular cells were obtained. The ultrastructure of the cells showed the decrease in vilious project, coated vesicle and lysosomal inclusion. Conclusion : The establishment of human glaucomatous trabecular cells culture in vitro made the culture system more perfect. The morphologic changes might be related to the abnormal functions of human trabecular meshwork cells. Eye Science 1998; 14 : 134 - 737.     

糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究

目的 探索糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法及超微结构的特点。方法 从小梁切除术中取得的巩膜内板层,应用组织学培养方法进行患者小梁细胞体外培养及鉴定,并将糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞与正常小梁细胞的超微结构进行分析和比较。结果 糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞经鉴定确为小梁细胞,但与正常小梁细胞相比,其细胞的微绒毛、吞饮小泡及胞浆的溶酶体含量较少。结论 糖皮质激素性青光眼患者小梁     

青光眼病人小梁细胞体外培养、冻存与复苏

目的：探索青光眼病人小梁细胞体外培养和保存方法。方法：从小梁切除术取得的巩膜内板层，应用组织培养方法进行病人小梁细胞体外培养，完成鉴定工作。并将第四代的青光眼病人小梁细胞冻存，冻存２周，１个月，２个月，半年后，将细胞复苏，观察复苏后小梁细胞的生长情况。结果：青光眼病人小梁组织培养出的细胞经鉴定为小梁细胞，培养的小梁细胞经冷冻保存，复苏率超过８０％。结论：青光眼病人小梁细胞体外培养及冻存复苏成功，使     

人血管内皮细胞体外培养及鉴定

目的：探讨人血管内皮细胞培养方法,提高人血管内皮细胞培养的成功率。方法：采用“０．２％胶原酶Ⅲ灌流消化法”培养人脐静脉内皮细胞,当细胞繁殖融合后,用０．０６２５％胰蛋白酶消化法传代;根据细胞生长特点,通过形态学特征与免疫组化检查对细胞进行鉴定。结果：培养细胞２４小时完全贴壁,生长旺盛,３～５天融合传代,形态学上为典型的血管内皮细胞;鼠抗人血管皮细胞单克隆抗体（ＣＤ３４）抗体染色呈阳性。结论：“灌流     

体外人羊膜培养兔角膜缘上皮细胞的细胞形态与连接复合体形成的研究

目的观察体外人羊膜上培养出的兔角膜缘上皮细胞形态特征及与羊膜基底膜连接复合体的形成。方法将15只新西兰白兔角膜缘组织（2mm×2mm）,于37℃ 5％ CO2孵箱中用1．2U／ml裂解酶Ⅱ处理20min,之后在人羊膜上皮面先行浸液培养2周,后行气-液培养2周。于培养期间,每周定期进行透射电镜检查,以观察连接复合体的形成过程,培养至第4周后,采用AE5免疫组织化学、高碘酸．希夫、苏木精-伊红等染色方法鉴定分化的上皮细胞,鉴别杯状细胞,观察细胞的形态特征。结果兔角膜缘上皮细胞体外培养10—14d可充满人羊膜面,对AE5免疫组织化学方法染色分化出的上皮细胞均呈阳性而高碘酸．希夫染色均呈阴性。苏木精-伊红染色显示从兔角膜缘上皮细胞分化出的上皮细胞与正常兔角膜上皮细胞相比无明显差异;自培养至第14天均未见与羊膜基底膜的连接复合体形成;于第21天时仅观察到初始阶段的连接复合体,第28天时仍未见明显变化。结论于体外人羊膜上培养的兔角膜缘上皮细胞分化出的细胞是角膜上皮细胞,其形态与正常兔角膜上皮细胞相同,并与羊膜基底膜仅形成初始阶段的连接复合体。     

人眼脉络膜血管内皮细胞体外培养和细胞特征观察

目的建立人眼脉络膜血管内皮细胞快速培养方法并观察细胞的特征，为研究与人眼脉络膜血管内皮细胞有的关眼部疾病提供体外研究模型。方法采用胰酶、胶原酶对人眼脉络膜组织块进行两步消化，应用免疫磁珠CD31Dynabeads对消化后的细胞混合悬液分选纯化后获得人眼脉络膜血管内皮细胞并进行细胞培养；采用形态学观察、透射电子显微镜扫描、内皮细胞特异标志FⅧ因子、CD31、CD34的免疫组织化学染色观察培养的人眼脉络膜血管内皮细胞特征。结果培养的细胞呈多边形、类圆形，细胞融合后呈铺路石样外观，传代后的细胞仍保持圆形或多边形，融合成单层时呈鹅卵石样排列，细胞表面吸附的磁珠明显减少；培养细胞胞浆内有内皮细胞特异性的棒状小体（Weibel-Palade小体），内皮细胞特异标志FⅧ因子、CD31、CD34染色阳性。结论本实验研究成功培养出人眼脉络膜血管内皮细胞，纯度较高，方法易行，可获得足够实验研究的细胞数量。（中华眼底病杂志，2007，23：126-129）     

人眼小梁细胞体外滤膜培养及其通透阻力测定

目的:建立人眼小梁细胞体外滤膜培养体系及通透阻力测定的模型。方法:将永生化的人眼小梁细胞株用酶消化法传代于细胞培养池的PET膜上,观察细胞的生长情况,同时分别在细胞融合后3、5d和1、2周,应用内皮细胞电阻测量仪(EVOM)测定滤膜上单层小梁细胞电阻,客观评价其通透阻力。结果:人眼小梁细胞在滤膜上生长良好,单层融合后3、5d和1、2周的平均电阻分别为(36.4±1.4)Ω、(35.0±1.7)Ω、(36.1±2.9)Ω、(39.3±3.0)Ω,各时间点无显著统计学差异(P=0.305)。结论:人眼小梁细胞滤膜上培养单层融合后,在不同时间段其阻力基本稳定。滤膜培养体系及应用EVOM对其通透阻力的测定可作为今后对小梁细胞特性研究的一个新的较好模型。