人眼虹膜色素上皮细胞体外培养及超微结构观察

应用体外培养传代对１０例人尸眼虹膜色素上皮细胞进行观察分析。结果表明：直接刮取的细胞进行培养较酶消化法更易存活传代。原代细胞在光镜下呈多角形单层生长，胞浆内有丰富的色素颗粒，核相对透明，有１～２个核仁。传代后的细胞色素颗粒减少；电镜下见胞浆富含色素，细胞膜有明显微绒毛；免疫组化检查角蛋白抗原呈阳性反应，符合虹膜色素上皮细胞的特点。虹膜含有某些生物活性物质，因此虹膜色素上皮细胞的体外培养可作为有关研究的基础。     

人眼小梁细胞体外培养,冻存与复苏

目的:建立人小梁细胞体外培养及对其进行冻存、复苏研究。方法:应用组织块培养方法进行人小梁细胞体外培养,将第3代的小梁细胞冻存,冻存1周、2周、1月、2月后细胞给予复苏,观察复苏后细胞的生长情况。结果:人眼小梁细胞体外培养成功。冻存的小梁细胞复苏成功,所有复苏率超过90％。结论:人眼小梁细胞体外培养及冻存复苏成功,为以后构建小梁细胞的cDNA文库,为筛选青光眼发病的相关基因提供有利的实验基础。眼科学报1998;14:73—75。     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

人眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的：观察体外培养的人眼虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE)的生长情况，用透射电镜、细胞免疫化学实验鉴定其性质，为进一步研究IPE细胞生理，病理作用提供模型。方法：对来源于不同个体的健康人眼采用酶消化加显微分离法，分离IPE细胞，对其进行培养，传代，冻存和复苏。用透射电镜，细胞免疫化学法鉴定细胞性质。建立IPE细胞的有限细胞系，结果：原代培养的IPE呈棕黑色多角形或不规则形，24h内73％细胞贴壁，贴壁体积变大呈多边形或方形，胞核轮廓变清，胞浆内充满黑色素颗粒，分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少，4－6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失，部分形态变为成纤维细胞状，电镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛，胞浆内含少量色勾颗粒，细胞免疫化学抗角蛋白与抗S－100染色显示IPE细胞胞质呈鲜红色着色，结论：采用酶消化加显微分离法可以建立人IPE的有限细胞系。     

人眼脉络膜黑色素细胞的培养与鉴定

目的观察体外培养人眼脉络膜黑色素细胞的生长状况，用透射电镜、细胞免疫化学染色鉴定其性质，为进一步研究脉络膜黑色素细胞及相关眼病提供模型。方法将脉络膜组织用胰蛋白酶与胶原酶多次消化，分离得到的细胞用F12培养液进行培养、传代、冻存和复苏。用透射电镜、细胞免疫化学染色鉴定细胞性质。结果初分离的脉络膜黑色素细胞呈棕色球状体，24h内贴壁。贴壁细胞渐变为双极、三极或树枝状，常有较长的分支，胞浆内含有棕黄色色素颗粒，传代后色素量保持稳定。电镜下可见细胞表面有少量微绒毛，胞浆内的黑素体沿胞膜分布或簇状分布。体外培养的脉络膜黑色素细胞S-100表达阳性，细胞角蛋白表达阴性。结论采用胰蛋白酶与胶原酶多次消化并在培养液中添加多种刺激因子，可建立人眼脉络膜黑色素细胞的有限细胞系。     

人结膜上皮细胞的培养鉴定及液氮冻存

目的：探索人眼结膜上皮细胞体外培养和细胞保存的最佳方法，建立人结膜上皮细胞，进一步研究人结膜的病理、生理特点及为毒理试验提供可靠的细胞模型。方法：分别用组织块培养法、机械分离法及混合消化液培养法体外培养正常成年人结膜上皮细胞，通过观察细胞形态、生长特性并用原位免疫组化方法鉴定培养细胞；收集第３代和第４代融合的细胞液氮冻存，保存３０天后复苏，观察复苏成功率。结果：３种取材方法中，混合消化液培养法细胞     

青光眼病人小梁细胞体外培养、冻存与复苏

目的：探索青光眼病人小梁细胞体外培养和保存方法。方法：从小梁切除术取得的巩膜内板层，应用组织培养方法进行病人小梁细胞体外培养，完成鉴定工作。并将第四代的青光眼病人小梁细胞冻存，冻存２周，１个月，２个月，半年后，将细胞复苏，观察复苏后小梁细胞的生长情况。结果：青光眼病人小梁组织培养出的细胞经鉴定为小梁细胞，培养的小梁细胞经冷冻保存，复苏率超过８０％。结论：青光眼病人小梁细胞体外培养及冻存复苏成功，使     

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究

目的探讨体外培养原代人眼Tenon’s囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型。方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon’s囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞。用免疫荧光方法鉴定细胞。对细胞进行传代、冻存和复苏的观察。对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线。结果人眼Tenon’s囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形。免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性。细胞多次传代后依然生长迅速,3 d即可长满瓶底。复苏后细胞2~6 d处生长对数期,增殖能力良好。结论人眼Tenon’s囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究。     

兔視網膜色素上皮細胞的培養與保存

目的探索一种有效的体外分离兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的良好方法,并观察RPE细胞冻存复苏前后的形态学特点。方法用两步酶法分离兔RPE细胞,第一步酶(透明质酸酶 胰蛋白酶),用于松解视网膜神经上皮细胞与RPE细胞之间的连接;第二步(胰蛋白酶)用于离散RPE细胞,制成细胞悬液;然后用慢冻速融方法对细胞进行冷冻保存及复苏,最后用4种方法(RPE片层观察、H-E染色、免疫组化法及光、电镜观察法)观察RPE细胞在冻存前后的形态特点。结果 用此方法分离培养的细胞其结构完整,纯度高,收获量多,在体外生长旺盛,达到铺满汇合的时间缩短,同时维持体内细胞的许多生物学和形态学特点。细胞冻存复苏后的存活率高达80％左右,且与冻存前细胞形态相比未见明显差别。结论 此分离培养方法及冻存复苏法是高效可行的。     

改良兔角膜细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的建立一种改良的兔角膜细胞冻存和复苏的方法。方法兔角膜细胞消化培养。取第2代细胞分别进行传统和改良方法冻存，于冻存后的第2周、3个月、6个月、la分别行传统和改良的复苏方法。用MTT法测细胞生长曲线，应用三因素分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法、不同复苏时间三因素单独和（或）组合对细胞复苏率的影响。结果兔角膜细胞体外生长良好。培养细胞Vim单克隆抗体阳性。细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响，不受复苏时间及与冻存和复苏方法单、双因素及三因素的影响。冻存复苏后生长曲线良好。结论改良后的兔角膜细胞冻存和复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性，细胞复苏率高，适用于体外实验研究。     

Cultivation and Ultrastructural Investigation of Human Iris Pigment Epithelial Cells

Purpose; To study the human iris pigment epithelial cells cultivation in vitro. Methods: The iris pigment epithelial cells were isolated by scraping directly or by enzyme digestion and cultured in vitro. The cells were observed under the transmission electron microscope and analized by means of immunohistochemical assay.Results: The cells obtained by scraping were easier to grow and to be passaged than those obtained by enzyme digestion. The primary cells appeared multigonal and arranged in mono-layer. Abundant pigment granules were in the cytoplasm and diminished in succeeding generations . The maculae occludentes and desmosomes and microvilli which were characteristics of epithelial cells could be found under the electronmicroscope. The immunohistochemical assay showed positive reaction of keratin antigen in cultured cells.Conclusion: The human iris pigment epithelial cells could be cultured in vitro and the cells in primary generation some characteristics be preserved. Eye Science 1997; 13: 137 - 140     

人视网膜色素上皮细胞对色素颗粒的吞噬作用

为检测培养的人视网膜色素上细胞对色素颗粒的吞噬活性,将从原代培养的ＲＰＥ细胞中提取的色素颗粒加入到培养的第８代ＲＰＥ细胞培养中,２４小时后,可见色素颗粒出现于细胞浆中,４天后,ＲＰＥ细胞胞浆中布满大量的色素颗粒。表明培养的ＲＰＥ细胞具有吞色素颗粒的活性。同时,该方法也为细胞移植提供了大量的细胞来源。     

视网膜母细胞瘤SO—Rb70细胞系的建立及液氮冻存和复苏

目的:建立新的人视网膜母细胞瘤细胞株,对其进行冻存和复苏,为临床、科研提供Rb细胞库。方法:用精确优化的取材,不经离心,直接通过洗涤吹打细胞后接种,并根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集建株的Rb_(70)细胞作液氮冻存及复苏。结果:成功建立SO-Rb_(70)细胞株,共冻存8批细胞,进行了6次复苏实验,4次获成功。结论:经液氮冻存的人Rb_(70)细胞,复苏后生长良好,保持了细胞原有的生物活性及细胞特征,为Rb的深入研究提供了丰富的实验研究材料。眼科学报1998;14:80—82。     

杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞

目的：研究重组杆状病毒(baculovinus)载体介导β—半乳糖苷酶基因(LacZ)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法：将质粒pCMV—β中的CMV—LacZ表达盒插入杆状病毒表达栽体pFast BacI的Eco RI／Hind Ⅲ位点，构建重组质粒pBac—β，并利用Bac—to—Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV—β。将MOI为200的BV—β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞，24h后进行X-gal染色。在显微镜下观察IPE中LacZ表达阳性的情况，记录阳性细胞所占的百分比。结果：限制性酶切分析及测序结果表明，我们已成功构建表达质粒pBac—β及重组杆状病毒BV—β。X-gal染色证实杆状病毒介导LacZ在细胞中的表达呈蓝色，弥漫于整个胞浆。感染后24h时表达阳性率达85％。结论：重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达，为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据。     

虹膜周边切除手术标本的色素上皮细胞体外培养与超微结构研究

目的：体外培养虹膜周边切除标本中的色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)，并进行生物学检测。方法：用酶-显微解剖-酶分离法培养IPE细胞并传代，免疫组化方法鉴定，透射电镜观察超微结构。结果：酶-显微解剖-酶分离法在小标本可成功获得较高纯度和密度的IPE细胞。其形态与免疫标志物表达与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞相似。结论：培养的IPE细胞为自体移植提供了较可靠的细胞来源。