三氧化二砷诱导的视网膜母细胞瘤SO-Rb50细胞白噬的研究

背景细胞的自噬是肿瘤细胞非凋亡形式的死亡过程,研究证实三氧化二砷（As2O3）可诱导肿瘤细胞凋亡,但As2O3是否可致SO—Rb50细胞发生自噬的研究鲜有报道。目的探讨As2O3体外诱导SO—Rb50细胞自噬的作用。方法用浓度为0．5、1．0、2．0、4．0μmol／L的As2O3培养液及不含As2O3的未处理组处理SO—Rb50细胞系48h,采用MTT法测定各As2O3,浓度组SO—Rb50细胞的吸光度（As2O3）值。构建自噬标志物磷酸化绿色荧光蛋白（pGFP）-LC3体外转染SO—Rb50细胞,并分为新鲜RPMI一1640培养组（未处理组）、As2O3,RPMI一1640培养组（As2O3处理组）和rapamycin培养组（阳性对照组）,于48h后行激光共焦显微镜检测细胞自噬;用自噬特异性染料单丹磺酰戊二胺（MDC）行荧光染色检测SO—Rb50细胞的自噬,并用透射电子显微镜检测SO—Rb50细胞的自噬表现,采用流式细胞仪定量检测不同浓度As2O3,处理组自噬泡阳性细胞百分比。结果未处理组和0．5、1．0、2．0、4．0txmolAs2O3,作用48h后SO—Rb50细胞的A570值分别为2．194＋0．066、1．841±0．213、1．035±0．046、0．374±0．042和0．167±0．019,总体比较差异有统计学意义（F=547．636,P〈0．05）,其中各浓度As2O3组A。值均明显低于未处理组,差异均有统计学意义（均P=0．000）。As2O3处理组和阳性对照组可见GFP—LC3融合蛋白呈点状聚集在相应的自噬泡,未处理组GFP—LC3呈弥散分布。透射电子显微镜检查可见未处理组SO—Rb50细胞超微结构正常,As2O3处理组和阳性对照组见大量双层膜状结构及自噬溶酶体。未处理组48h见极少量MDC阳性荧光颗粒,As2O3处理组及阳性对照组48h可见明显的MDC阳性荧光颗粒,聚集在细胞质相应的自噬发生区。流式细胞术检测发现未处理组和0．5、1．0、2．0、4．0μmol／LAs2O3及rapamycin作用48h后自噬泡阳性的SO—Rb50细胞百分比分别为0、15．6％、42．7％、57．9％、79．5％和89．0％,随As2O3,浓度的增加MDC阳性细胞百分比递增。结论As2O3,抑制SO—Rb50细胞的生长和增生,并致SO—Rb50细胞发生自噬;SO—Rb50细胞经As2O3处理后,自噬的发生早于细胞核的改变,早中期自噬程度呈明显的As2O3浓度依赖性。     

人视网膜母细胞瘤耐药细胞系SO-Rb50/CBP的建立及耐药相关基因表达检测

目的用卡铂诱导人视网膜母细胞瘤SO-Rb50成为耐药细胞SO-Rb50/CBP,检测其生物学特性,并探讨其耐药机制。方法以人视网膜母细胞瘤SO-Rb50为亲本细胞,采用卡铂高浓度间歇诱导法诱导多药耐药细胞SO-Rb50/CBP。MTT法测定其药物敏感性及生长曲线、倍增时间;分别用免疫细胞化学、流式细胞术对MRP、GST-π蛋白表达进行检测,用RT-PCR检测耐药相关基因MRP、GST-π的表达。结果耐药细胞SO-Rb50/CBP的耐药指数为15.7。亲本细胞与耐药细胞群体倍增时间分别为44.32h和50.9h。SO-Rb50/CBP对CBP、DDP、VCR、MMC、VP-16和5-FU的耐药指数分别为15.7、6.89、5.68、4.58、2.28和1.88。免疫细胞化学SO-Rb50/CBP的GST-π和MRP表达的阳性率分别为96.19%和90.21%,亲本细胞两种蛋白的阳性率分别为20.12%和30.48%。SO-Rb50/CBP的MRP及GST-π的mRNA表达水平比SO-Rb50明显增高。结论诱导出耐卡铂的视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50/CBP呈高度耐药,且存在多药耐药现象。其耐药现象的产生,可能与GST-π和MRP耐药蛋白表达的增加有关。     

卡铂及足叶乙甙对视网膜母细胞瘤细胞体外药物敏感实验研究

目的 :为视网膜母细胞瘤临床化疗筛选对肿瘤作用敏感的化疗药物。方法 :采用MTT法 ,用不同类型、不同浓度的化疗药物 (卡铂及足叶乙甙 )作用于体外培养的SO RB5 0细胞系 ,观察其细胞生长的情况 ;观察加用各种化疗药物对视网膜母细胞瘤细胞生长抑制的敏感性及作用的有效药物浓度。结果 :SO RB5 0细胞加入不同浓度的化疗药物 (卡铂及足叶乙甙 )后细胞生长受到抑制 ,其肿瘤抑制率与药物浓度呈相关关系。卡铂及足叶乙甙对SO RB5 0细胞系作用 48h的IC50 值分别为 :0 335 μg/ml ,0 113μg/ml。 结论 :SO RB5 0细胞对卡铂及足叶乙甙两种化疗药物均敏感 ,根据其IC50 值对RB细胞的敏感性为足叶乙甙大于卡铂     

Y27632体外诱导视网膜色素上皮细胞转分化为神经元样细胞的初步研究

Objective To investigate the feasibility of Y27632 to induce transdifferentiation from human retinal pigment epithelial(hRPE)cells into neuron-like cells in vitro.Methods The third to sixth generation of primary hRPE cells were cultured with 2% fetal bovine serum+Dulbecco's modified eagle medium/F12 culture solution,with(experimental group)or without(control group)10 μmol/L Y27632.At 3,6 hours and 1,3,5,7 days after induction,the morphologic changes of RPE cells were observed by inverted microscope.The expression rate of CK18,Map2,NF200 and Pax6 at 3 days after induction in the experimental and control group were detected by immunofluorescent staining.χ2 test was employed for comparison between the two groups.Results 50.1% cells of the experimental group formed axon-like processes and interconnected each other with typical neuron-like appearance.The expression rates of CK18,Map2,NF200 and Pax6 in the experimental group were 43.88% ,31.90% ,57.45% and 65.79% .while the above indexes in the control group were 93.97% ,4.49% ,22.37% and 8.33% respectively.Compared the expression rate of CK18(χ2=64.763),Map2(χ2=23.634),NF200(χ2=21.261)and Pax6(χ2=25.946)between the two groups,the differences were significant(P＜0.01).Conclusion The hRPE cells can be trans-differentiated into neuron-like cells in vitro bv Y27632.     

人视网膜色素上皮细胞原代培养冻存和复苏方法改进

目的 优化建立一种简单有效的人视网膜色素上皮细胞(RPE)的原代培养、冻存和复苏的方法,对细胞进行鉴定,为研究RPE 的功能和治疗有关眼病提供细胞来源.方法 采用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)二次消化分离细胞并进行传代,以0.125%胰酶进行传代,用免疫组织化学检测进行角蛋白与S100 表达鉴定RPE.利用-80 ℃冰箱对细胞冻存,复苏后观察细胞活性.结果 RPE 体外生长旺盛、1 h 贴壁.初期为圆型,胞壁内充满黑色色素,传代后细胞呈圆型、不规则形,细胞透亮.免疫组织化学角蛋白与S100 均呈强阳性,证实培养的是RPE 细胞,所获细胞纯度100%.冻存细胞复苏后生长旺盛,细胞形态与复苏前相比无区别.结论 二次胰蛋白酶消化分离细胞数量多,能成功建立RPE 的体外培养模式,用-80 ℃冻存RPE 的方法简便,成本低,冻存复苏后细胞存活率及细胞形态不受影响,是目前较理想的RPE 细胞保存方法.     

原发于眼附属器的非何杰金氏淋巴瘤(44例临床病理分析)

44例原发于眼附属器的非何杰金氏淋巴瘤,男32例,女12例,平均发病年龄45.7岁。有完整资料的36例中,眼睑及结膜19例,眼眶17例,其中3例儿童均原发于眼睑,在这35例中,根据临床表现分为急性型的8例(22.86％),慢性型28例(77.14％)。急性型起病急,迅速恶化,预后极差,组织病理学分型多属高度恶性淋巴瘤。慢性型起病及发展均较缓慢,预后较佳,组织病理学分型多属低发及中度恶性淋巴瘤。44例的组织病理学分型:结节型5例(11.36％),弥漫型39例(88.64％),属B细咆系的42例(95.45％),T细胞系2例(4.55％)。随访3年的26例,结节型的5例,无一例死亡:弥漫型的21例,死亡9例。     

γ-干扰素对培养人结膜上皮细胞及泪腺上皮细胞的影响

γ-干抗素(interferon-γ,IFN-γ)是致炎作用很强的细胞因子,在机体各类炎性反应过程中起着重要的作用，它不仅可以诱导多种上皮缅胞过量表达细胞间黏附分子-1（intercellular adbesion molecule-1,ICAM-1,CD54)、主要组织相容性抗原(HLA-DR)等，而且可诱导细胞凋亡。有研究发现，Sjogren患者泪腺及涎腺中IFN-γ、白细胞介素-1(IL-1)及CD54的表达增高，但其相互关系，尤其IFN-γ人结膜和泪腺上皮细胞的炎性损伤作用尚不十分清楚。     

IL-1ra抑制IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1

【目的】明确IL-1ra是否对IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1有抑制作用及生物学意义,探讨表达ICAM-1在IL-1α诱导的外周血单个核细胞与眼眶成纤维细胞黏附中所起的作用。【方法】以IL-1α或/和IL-1ra处理培养的Graves’眼病(GO)患者和正常人眼眶成纤维细胞。用半定量RT-PCR法检测IL-1ra对IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1 mRNA的影响;用Western blot法和细胞免疫化学法检测IL-1ra对IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1蛋白的影响;用荧光显微镜检测预先标记的外周血单个核细胞(PBMC)与培养的眼眶成纤维细胞的黏附能力。用抗ICAM-1中和抗体来显示ICAM-1在IL-1α诱导的黏附过程中所起的作用。【结果】IL-1ra抑制IL-1α诱导的GO患者和正常人眼眶成纤维细胞表达ICAM-1 mRNA和蛋白呈剂量依赖性;IL-1ra抑制IL-1α诱导的PBMC与眼眶成纤维细胞的黏附呈浓度及时间依赖性。ICAM-1 mRNA和蛋白被抑制的方式与眼眶成纤维细胞受IL-1ra处理后与PBMC黏附的减弱明显平行。而且,抗ICAM-1单克隆抗体抑制PBMC黏附到眼眶成纤维细胞呈浓度依赖性。【结论】IL-1ra能够在mRNA和蛋白水平抑制IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1,IL-1ra抑制IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞表达ICAM-1可能在减弱IL-1α诱导的PBMC黏附到成     

人视网膜胶质细胞的原代培养与鉴定方法

背景 人视网膜胶质细胞在视网膜增生性疾病的研究中有重要作用,以往研究者已成功地培养了人视网膜胶质细胞,但方法学有待进一步改进以达到细胞收获量更大的目的. 目的 建立快速、收获量大且纯度高的视网膜胶质细胞的培养方法,对目标细胞的抗原表达特点进行分析. 方法 取正常人角膜移植供体眼球分离视网膜组织,采用质量分数2％胰蛋白酶和质量分数0.133％胶原酶Ⅵ用二步法消化获取人视网膜胶质细胞,用含质量分数10％胎牛血清的人内皮细胞培养液,其中添加内皮细胞生长因子(β-ECGF)和肝素钠,对分离的细胞进行体外培养,培养皿用纤维黏连蛋白(FN)包被以促进人视网膜胶质细胞贴壁.观察收获的目标细胞的形态特征,采用活体显微镜下形态学观察、常规组织学观察法观察目标细胞的生长,同时采用免疫组织化学法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(Vimentin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S-100、CD34、Ⅷ因子在细胞中的表达以鉴定目标细胞. 结果 应用胰蛋白酶、胶原酶二步消化法可成功获取人视网膜胶质细胞,原代培养的细胞72 h贴壁,第9～10天细胞达到融合状态呈花瓣状;常规组织学观察显示细胞核呈鲜亮蓝色,细胞质(盘膜)呈淡红色,培养细胞GFAP、Vimentin呈强阳性表达,NSE、S100、CD34、Ⅷ因子相关抗原表达呈阴性反应. 结论 应用胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化法以及利用10％胎牛血清的人内皮细胞培养基,添加生长因子和肝素钠,并用FN包被培养皿进行体外培养可达到快速、大量分离和纯化人视网膜胶质细胞的目的,鉴定结果提示培养的目标细胞为人视网膜胶质细胞,其形态与以往报道的有所不同,具体特点尚需进一步研究.     

人结膜上皮细胞的培养鉴定及液氮冻存

目的：探索人眼结膜上皮细胞体外培养和细胞保存的最佳方法，建立人结膜上皮细胞，进一步研究人结膜的病理、生理特点及为毒理试验提供可靠的细胞模型。方法：分别用组织块培养法、机械分离法及混合消化液培养法体外培养正常成年人结膜上皮细胞，通过观察细胞形态、生长特性并用原位免疫组化方法鉴定培养细胞；收集第３代和第４代融合的细胞液氮冻存，保存３０天后复苏，观察复苏成功率。结果：３种取材方法中，混合消化液培养法细胞