人眼小梁细胞体外培养,冻存与复苏

目的:建立人小梁细胞体外培养及对其进行冻存、复苏研究。方法:应用组织块培养方法进行人小梁细胞体外培养,将第3代的小梁细胞冻存,冻存1周、2周、1月、2月后细胞给予复苏,观察复苏后细胞的生长情况。结果:人眼小梁细胞体外培养成功。冻存的小梁细胞复苏成功,所有复苏率超过90％。结论:人眼小梁细胞体外培养及冻存复苏成功,为以后构建小梁细胞的cDNA文库,为筛选青光眼发病的相关基因提供有利的实验基础。眼科学报1998;14:73—75。     

糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养和超微结构研究

目的 探索糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞体外培养方法及超微结构的特点。方法 从小梁切除术中取得的巩膜内板层,应用组织学培养方法进行患者小梁细胞体外培养及鉴定,并将糖皮质激素性青光眼患者小梁细胞与正常小梁细胞的超微结构进行分析和比较。结果 糖皮质激素性青光眼患者小梁组织培养的细胞经鉴定确为小梁细胞,但与正常小梁细胞相比,其细胞的微绒毛、吞饮小泡及胞浆的溶酶体含量较少。结论 糖皮质激素性青光眼患者小梁     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

改良兔角膜细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的建立一种改良的兔角膜细胞冻存和复苏的方法。方法兔角膜细胞消化培养。取第2代细胞分别进行传统和改良方法冻存，于冻存后的第2周、3个月、6个月、la分别行传统和改良的复苏方法。用MTT法测细胞生长曲线，应用三因素分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法、不同复苏时间三因素单独和（或）组合对细胞复苏率的影响。结果兔角膜细胞体外生长良好。培养细胞Vim单克隆抗体阳性。细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响，不受复苏时间及与冻存和复苏方法单、双因素及三因素的影响。冻存复苏后生长曲线良好。结论改良后的兔角膜细胞冻存和复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性，细胞复苏率高，适用于体外实验研究。     

人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的：建立人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的冻存和复苏方法。方法：根据慢冻速融的细胞冻存原则，将原代或传代1～2次培养的人RPE细胞，加入10%二甲基亚砜作为保护剂，液氮中冻存。复苏时将冻存细胞在60℃、2分钟内融化，用台盼蓝染色测定细胞存活率，用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色作细胞鉴定，每日计算细胞数以确定细胞生长曲线。 结果：经冻存复苏后的RPE细胞的存活率达90%，生长状态与对照组无差异，抗人角蛋白染色阳性，细胞对数生长期在1～4天，群体细胞倍增期约为1.55天。 结论：人RPE细胞液氮冻存可保持生物活性，复苏后生长良好，保持了细胞特征。这可提供细胞系，方便了体外实验，并可能作为RPE细胞移植治疗一些眼底病的细胞库。 （中华眼底病杂志，1997，13：157-159）     

人眼虹膜色素上皮细胞体外培养、冻存与复苏

目的：建立人眼虹膜色素上皮细胞体外培养并对其进行冻存与复苏。方法：直接刮取虹膜色素上皮细胞组织碎屑进行培养,光镜观察生长特性及形态特点,透射电镜观察其超微结构。根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集细胞进行液氮冻存,至少2个月后进行复苏。结果：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养成功,原代细胞在光镜下呈多角形单层生长,胞浆内有丰富的色素颗粒;电镜下见胞浆富含色素、细胞器丰富、细胞膜有明显微绒毛、微丝、相监细胞之间可见桥粒连接。共冻存6批细胞,进行4次复苏实验均成功,每镒复苏细胞存活为90％。结论：人眼虹膜色素上皮细胞体外培养的建立及冻存、复苏的成功,为研究某些疾病提供有利的基础。     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

人结膜上皮细胞的培养鉴定及液氮冻存

目的：探索人眼结膜上皮细胞体外培养和细胞保存的最佳方法，建立人结膜上皮细胞，进一步研究人结膜的病理、生理特点及为毒理试验提供可靠的细胞模型。方法：分别用组织块培养法、机械分离法及混合消化液培养法体外培养正常成年人结膜上皮细胞，通过观察细胞形态、生长特性并用原位免疫组化方法鉴定培养细胞；收集第３代和第４代融合的细胞液氮冻存，保存３０天后复苏，观察复苏成功率。结果：３种取材方法中，混合消化液培养法细胞     

兔视网膜色素上皮细胞的培养与保存

目的 探索一种有效的体外分离兔视网膜色素上皮（RPE）细胞的良好方法，并观察RPE细胞冻存复苏前后的形态学特点。方法 用两步酶法分离兔RPE细胞，第一步酶（透明质酸酶 胰蛋白酶），用于松解视网膜神经上皮细胞与RPE细胞之间的连接；第二步（胰蛋白酶）用于离散RPE细胞，制成细胞悬液；然后用慢冻速融方法对细胞进行冷冻保存及复苏，最后用4种方法（PRE片层观察、H-E染色、免疫组化法及光、电镜观察法）RPE细胞在冻存前后的形态特点。结果 用此方法分离培养的细胞其结构完整，纯度高，收获量多，在体外生长旺盛，达到铺满区合的时间缩短，同时维持体内细胞的许多生物学和形态学特点。细胞冻存复苏后的存活率高达80%左右，且兴冻存前细胞形态相比未见明显差别。结论 此分离培养方法及冻存复苏法是高效可行的。     

The Study on Culture and Ultrastructure of Glaucomatous Trabecular Cells in Vitro

Purpose : To establish the culture system of human glaucomatous trabecular cells in vitro and study their ultrastructures.Methods : The trabecular specimens from trabeculectomy were cultured in vitro and passaged 3 times, then identified. Moreover, the glaucomatous cells were observed with electron microscope while compared with the normal ones.Result: Cultured human glaucomatous trabecular cells were obtained. The ultrastructure of the cells showed the decrease in vilious project, coated vesicle and lysosomal inclusion. Conclusion : The establishment of human glaucomatous trabecular cells culture in vitro made the culture system more perfect. The morphologic changes might be related to the abnormal functions of human trabecular meshwork cells. Eye Science 1998; 14 : 134 - 737.     

视网膜母细胞瘤SO—Rb70细胞系的建立及液氮冻存和复苏

目的:建立新的人视网膜母细胞瘤细胞株,对其进行冻存和复苏,为临床、科研提供Rb细胞库。方法:用精确优化的取材,不经离心,直接通过洗涤吹打细胞后接种,并根据慢冻速融的细胞冻存原则,定期收集建株的Rb_(70)细胞作液氮冻存及复苏。结果:成功建立SO-Rb_(70)细胞株,共冻存8批细胞,进行了6次复苏实验,4次获成功。结论:经液氮冻存的人Rb_(70)细胞,复苏后生长良好,保持了细胞原有的生物活性及细胞特征,为Rb的深入研究提供了丰富的实验研究材料。眼科学报1998;14:80—82。     

Fibronectin in human trabecular drainage channels

Fibronectin, an extracellular glycoprotein, has been shown to be produced by human trabecular cells in culture by our group as well as Polansky and co-investigators. Studies of Rodrigues et al suggested that fibronectin may be one of several glycoproteins found in increased amounts in the corneoscleral trabecular meshwork of glaucomatous eyes. The authors have developed a sensitive immunoassay utilizing avidin-biotinylated enzyme complex (ABC) to detect low levels of fibronectin in frozen sections of human eyes. The authors have used this immunoassay together with a perfusion technique to demonstrate distribution patterns of fibronectin present in human aqueous drainage channels. The authors found that fibronectin is present in larger quantities in the aqueous drainage channels than in the surrounding tissues in 18 eyes from older patients.     

Aqueous humor stimulates the migration of human trabecular meshwork cells in vitro

PURPOSE: Depletion of trabecular meshwork cell numbers is a feature of the outflow system in aging and in primary open-angle glaucoma. It is possible that migration stimulated by factors present in aqueous humor may contribute to the cell loss. This investigation assessed the chemoattractant potential of glaucomatous and nonglaucomatous human aqueous humor and fibronectin, one of its constituents, on a range of cultured trabecular meshwork cell lines. METHODS: Migration was assessed in 48-well modified Boyden chambers. The potential migratory stimulants were soluble fibronectin and glaucomatous and nonglaucomatous aqueous humor. The glaucomatous aqueous samples were collected from patients undergoing trabeculotomy for primary open-angle glaucoma and the normal aqueous from normal bovine eyes and patients undergoing cataract surgery. The target cell types were normal human and bovine meshwork cells grown from explants and two human transformed meshwork cell lines from a normal (HTM-5) and a glaucomatous (HTM-3) source. RESULTS: Soluble fibronectin stimulated all the target cells to migrate with an optimal concentration ranging from 1 to 30 microg/ml, and Zigmond Hirsch checkerboard analysis indicated that both chemotaxis and chemokinesis took place. All the aqueous humor samples stimulated migration of the meshwork cell lines at an optimal concentration of 200 microl/ml. Glaucomatous aqueous humor stimulated a greater migratory response than nonglaucomatous aqueous for two of the four target cell types (P < or = 0.03). Neutralization of the fibronectin content of nonglaucomatous and glaucomatous aqueous by addition of excess anti-fibronectin antibody indicated that fibronectin could account for 35% to 80% of the migratory activity of the aqueous. CONCLUSIONS: Aqueous humor contains potentially powerful chemoattractants for trabecular meshwork cells. The activity of one of these constituents, fibronectin, has been accounted for by this study. Glaucomatous aqueous appears to be as good and in some cases a better migratory stimulant than nonglaucomatous aqueous in vitro. The migratory evidence points to a trend that may help to explain cell loss in the aging meshwork and possibly some of the extra loss in primary open-angle glaucoma.     

人眼小梁细胞体外培养及生物学特性研究

目的:建立人眼小梁细胞培养方法并研究其生物学特性。方法:以体外组织块培养的方法获得培养的人小梁细胞,应用光镜、电镜观察细胞的形态学特征,并观察其免疫组化特性和细胞的生长曲线。结果:光镜下小梁细胞为扁平多角形、单层生长;电镜下细胞连接为点粘连和缝隙连接、细胞表面可见微绒毛、胞浆细胞器丰富;免疫组化染色对抗纤维连接蛋白(Anti—FN)、抗层粘连蛋白(Anti—LN)、抗神经元特异性烯醇化酶(Anti—NSE)单抗呈阳性,对抗第Ⅷ因子(Anti-ⅧFactor)单抗呈阴性;传代小梁细胞繁殖时间较长,10天后为平台期。结论:根据体外培养的小梁细胞的形态特点、生长特征、免疫组化特性可对其进行鉴定。人小梁细胞体外培养的成功,为在细胞和分子水平研究青光眼的发病机制提供了有利的条件。眼科学报 1996;12:64—69。