结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

载体质粒介导的TGF-β1短发夹RNA及TGF-β1反义RNA对人腹膜纤维化的影响

目的研究pcDU6载体质粒介导的转化生长因子β1(TGF-β1)短发夹RNA(shRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC)TGF-β1表达的影响,并与TGF-β1反义RNA对HPMC的作用比较.方法针对TGF-β1的以ggcc开始的21碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pcDNA3.1(-)载体(命名为pcDU6).2.对DNA双链通过BamHI酶切位点连接后形成中间由6碱基序列间隔的反向互补序列,构建成TGF-β1短发夹RNA的产生质粒.并构建反义TGF-β1基因真核表达载体.采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型.用脂质体转染表达TGF-β1 shRNA的pcDU6载体质粒和表达反义TGF-β1RNA的pcDNA3.1(-)的载体质粒导入高糖(4.25%D-葡萄糖)和细菌脂多糖(LPS)刺激下人腹膜间皮细胞.采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量分析HPMC中TGF-β1 mRNA的表达以及纤连蛋白(FN)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和胶原Ⅰ(Col Ⅰ)的mRNA表达.采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMC培养液中TGF-β1蛋白质水平以及FN和PAI-1的蛋白质水平.结果HPMC在高糖和LPS的刺激下可明显上调TGF-β1的表达(P＜0.01).TGF-β1反义RNA转染HPMC 24 h后,与对照组相比,FN、Col Ⅰ、PAI-1 mRNA分别下调17%、26%、9.6%;转染48 h后FN、PAI-1蛋白含量亦明显下降(P＜0.05).pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组较GS+LPS组及pcDU6空载体组明显下调TGF-β1的表达(P＜0.01);pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组间比较并无明显差别(P＞0.05);pcDNA3.1(-)的载体质粒介导的反义RNA组与pcDU6空载体组比较并无明显差别(P＞0.05);pcDU6载体质粒介导的TGF-β1 shRNA干扰组较pcDNA3.1(-)的载体质粒介导的反义RNA组明显下调TGF-β1的表达(P＜0.01).结论pcDU6载体质粒介导的TGF-β1shRNA能够明显抑制高糖和LPS刺激下的HPMC TGF-β1的基因表达,可能是防治CAPD患者腹膜纤维化的一种有效方法.     

RNA干扰质粒沉默转化生长因子β_1对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)的RNA干扰质粒(shRNA-TGF-β_1)对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响.方法 预先构建shRNA-TGF-β_1.取SD大鼠肾脏,置于4℃肝素生理盐水中以强化缺血再灌注损伤,用于移植.切除Wistar大鼠左肾后移植入供肾,术中采用以流体力学为基础的肾脏基因转染技术进行质粒转染.实验分为4组.T组为质粒组,受者注射shRNA-TGF-β_1质粒;H组为空质粒组,受者注射空质粒;Y组为单纯移植组,受者仅行肾移植,不注射任何质粒;J组为假手术组,只打开腹腔切除左肾,不进行肾移植.移植术后1、2和3个月时,切取各组受者的移植肾,检测TGF-β_1、Ⅰ型胶原及其mRNA的表达,检测Ⅰ型胶原组织定位,观察移植肾细胞外基质的沉积.结果 J组大鼠肾脏组织中仅有少量的TGF-β_1 mRNA表达.H组及Y组TGF-β_1 mRNA的表达较高.术后1个月时,T组TGF-β_1 mRNA的表达显著低于其他各组,随着时间的延长,其表达有所升高,但仍显著低于H组及Y组.各组TGF-β_1的表达与TGF-β_1 mRNA的表达有相同的变化趋势.T组Ⅰ型胶原mRNA的表达低于H组和Y组.各组Ⅰ型胶原的表达与其mRNA的表达有相同的变化趋势,Ⅰ型胶原主要位于H组和Y组的皮质小管区及髓质间质区,肾小球部位相对较少.T组移植肾纤维化程度低于H组和Y组.结论 转染shRNA-TGF-β_1能抑制移植肾TGF-β_1的表达,减少细胞外基质的生成,在一定程度上预防移植肾纤维化.     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

内质网蛋白29在肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的:观察TGF-β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化过程中内质网蛋白29(ERP29)表达变化及上调表达ERP29蛋白对TGF-β1诱导NRK52E细胞极性蛋白Par-3的影响。方法:应用TGF-β1(10 ng/ml)刺激NRK52E细胞,采用Western印迹和免疫荧光方法分别检测内质网蛋白29、Par-3mRNA及蛋白的表达;应用Lipofectmine2000将ERP29质粒瞬时转染NEK52E细胞,采用Western印迹方法检测细胞极性蛋白Par-3表达变化。结果:TGF-β1刺激后,NRK52E细胞内质网蛋白29表达呈时间依赖模式逐渐下调,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。脂质体转染外源性质粒pcDNA/ERP29上调表达ERP29可显著上调表达细胞极性蛋白Par-3。结论:TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中内质网蛋白29表达显著下调,基因转染上调表达ERP29可显著提高细胞极性蛋白Par-3表达,提示ERP29在维持细胞极性、阻抑转分化进程中发挥重要作用。     

反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据.方法应用脂质体将反义TGF-β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果①转染反义TGF-β1的KF体外增殖明显降低.②与未转染反义TGF-β1的KF相比,转染反义TGF-β1的KF凋亡发生率明显增高(差异有显著性意义,P＜0.05).结论反义TGF-β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡.     

pcDNA3.1(-)-hTGFβ3成纤维细胞稳定表达系统的构建与生长增殖活性研究

目的构建人转化生长因子β3的真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统,研究转基因TGFβ3对成纤维细胞生长增殖活性的影响。方法通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)TGFβ3质粒导入NIH3T3成纤维细胞,应用RTPCR与Westernblot检测hTGFβ3在真核细胞中的表达。经相差显微镜形态观察及四唑蓝比色实验法(MTT)检测细胞增殖活性。结果在10株转染和经G418反复筛选的NIH3T3成纤维细胞系中,有7株hTGFβ3mRNA及其蛋白的表达明显增强,其余3株细胞相对较弱或者没有表达。TGFβ3转基因稳定表达的NIH3T3成纤维细胞系的生长增殖明显减缓(P<0.05)。结论pcDNA3.1(-)TGFβ3真核表达载体转染NIH3T3成纤维细胞的稳定表达系统构建成功,转基因hTGFβ3在体外培养条件下可抑制成纤维细胞的增殖。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞胶原分泌的影响

目的比较结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸两种导入方法的优缺点,观察CTGF反义寡核苷酸对TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞胶原分泌的影响。方法分别用脂质体包裹和未包裹的CTGF反义寡核苷酸(分高剂量和低剂量)处理NRK52E肾小管上皮细胞,观察异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的反义寡核苷酸的导入情况和细胞的生长状态。采用RT-PCR和Western印迹方法检测CTGF和Ⅰ型胶原的表达。结果脂质体包裹有助于反义寡核苷酸的导入,于6h～9h细胞即出现生长抑制,形态改变。直接导入法反义寡核苷酸进入较慢,在96h内仍未出现明显细胞毒性。直接导入法中,反义寡核苷酸处理48h后,高、低剂量组CTGFmRNA和蛋白大部分受抑,72h时低剂量组CTGF的表达有少量的恢复。TGF-β1刺激能够显著增加Ⅰ型胶原分泌,加入CTGF反义寡核苷酸共同孵育48h,可以大部分取消TGF-β1的作用,而正义和错义的寡核苷酸没有作用。结论反义寡核苷酸直接导入细胞较慢,但仍然能够达到较好的抑制效果,且细胞毒性小,可以用于体外反义技术的研究。CTGF反义寡核苷酸能够抑制TGF-β1引起的肾小管上皮细胞胶原Ⅰ型分泌增多,表明阻断CTGF可能是延缓肾间质纤维化的有效手段。     

饰胶蛋白聚糖基因转染对大鼠肾系膜细胞转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体表达的影响

目的探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)拮抗肾小球硬化进展的作用是否与其抑制系膜细胞(MsC)转化生长因子βⅠ、βⅡ型受体(TGF-βRⅠ、TGF—βRⅡ)表达有关。方法经外源性TGF-βⅠ刺激培养的大鼠肾MsC，采用RT—PCR、Western印迹法检测其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表达。用脂质体介导法将DCN基因转染MsC，经筛选和鉴定，用RT—PCR、Western印迹法和免疫荧光法分别观察DCN基因转染对TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ表达的影响。结果经外源性TGF-βⅠ刺激的正常MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ基因转录及蛋白表达均明显升高，且呈时间依赖性，于作用24h达高峰。与转染空载体的MsC(1P-1)相比，转染。DCN基因的MsC克隆(3D-5，7D-1)的TGF-βRⅠmRNA表达分别为对照组的20％和32％，TGF-βRⅡmRNA表达分别为对照组的64％和59％；TGF-βRⅠ蛋白表达分别为对照组的34％和25％，TGF-βRⅡ蛋白表达分别为对照组的49％和57％。同时转染DCN基因也能阻止MsC对外源性TGF-βⅠ刺激所致的两种受体表达升高作用。结论过表达DCN基因的MsC，其TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和蛋白表达水平均明显降低，这可能是DCN拮抗由TGF-β介导的肾小球硬化发生的重要机制之一。     

miR-200a在TGF-β诱导口腔黏膜修复中的功能研究

目的探索miR-200a在TGF-β诱导口腔黏膜修复过程中表达水平的变化和功能。方法分离培养原代人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblast,HGF),加入不同浓度TGF-β,实时荧光定量PCR检测miR-200表达水平的变化。通过转染miR-200a模拟物增加miR-200a表达水平,利用Transwell实验检测细胞迁移能力,利用CCK-8实验检测细胞增殖活性,利用蛋白质免疫印迹实验检测细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平。结果 TGF-β处理会引起HGF细胞miR-200a表达水平下降,且随着TGF-β作用浓度增加,miR-200a表达下降比例增加;与对照组相比,转染miR-200a模拟物的实验组miR-200a表达水平上升,细胞增殖活性下降,迁移到Transwell下层小室的细胞数目降低,Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达水平下降。结论 miR-200a在TGF-β诱导口腔黏膜修复过程中可以抑制HGF的增殖活性、迁移能力和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,进而影响口腔黏膜的修复和重建。     

肾小球系膜细胞金属蛋白酶1组织抑制剂对血管内皮生长因子及转化生长因子β1表达的影响

目的:探讨高糖(葡萄糖25mmol/L)条件下大鼠肾小球系膜细胞(RMC)金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)对血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法:用高糖培养基体外培养未转染及分别用pcDNA3空载体、人反义TIMP-1基因重组真核表达载体转染的RMC24h,将细胞分为未转染组、空载体组及反义组,并设正常培养条件下的RMC作为正常对照组。RT-PCR检测各组RMC TIMP-1、VEGF及TGF-β1mRNA的表达。Western印迹检测胞质中TIMP-1、VEGF及TGF-β1蛋白的表达。免疫荧光检测各组RMC胞质中VEGF的表达。结果:高糖培养条件下未转染组及空载体组RMC大鼠TIMP-1、VEGF及TGF-β1mRNA表达均较对照组明显增加(P<0.01),而此两组间相应指标表达差异无统计学意义;反义组大鼠TIMP-1、VEGF mRNA表达较未转染组显著降低(P<0.01),而TGF-β1 mRNA表达则无变化。Western印迹也得到相同的结果。免疫荧光检测发现,未转染组及空载体组VEGF荧光表达较对照组显著增强,反义组荧光则较未转染组明显减弱。结论:高糖可促进RMC TIMP-1、VEGF及TGF-β1表达增加。在高糖条件下,TIMP-1可能位于VEGF上游,促进其表达;而TGF-β1表达并不受TIMP-1调控,高糖可能通过其他途径上调其表达。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1表达的影响

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ODN)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)mRNA表达和蛋白产生的影响,以明确CTGF在肾脏细胞外基质(ECM)降解中的作用。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HKC),以脂质体介导方法将CTGF反义ODN转染细胞。以TGF-β1(5μg/L)刺激HKC不同时间后,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测PAI-1mRNA表达;流式细胞仪法检测胞内PAI-1蛋白合成;Western印迹方法检测HKC分泌到上清中的PAI-1蛋白含量。结果TGF-β1可诱导HKC高表达CTGF和PAI-1。转染后6h,CTGF反义ODN可显著抑制TGF-β1诱导的HKCPAI-1mRNA表达。转染后24h,CTGF反义ODN可明显抑制胞内PAI-1蛋白合成,并减少了HKC分泌到胞外的PAI-1。结论CTGF在肾小管间质纤维化时ECM降解中起了关键调控作用,其反义ODN的导入可能是延缓肾小管间质纤维化的有效手段之一。     

PPARγ特异配体抑制肝星状细胞的活化

目的 研究不同浓度的过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)生物学特性的影响,以探究其在肝旱状细胞活化中的作用.方法 设立对照组,3μM罗格列酮组,10μM罗格列酮组,20μM岁格列酮组.用MTT法检测细胞的增殖情况;采用RT-PCR方法检测其中PPARγ、TGF-β1及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用Western blot法检测PPARy、Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达;用免疫细胞化学方法测定α-SMA表达的变化;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅰ型胶原表达的变化.结果 (1)RT-PCR:20μM罗格列嗣组或10μM罗格列酮组与3 μM罗格列酮组或对照组相比,PPARY mRNA表达显著增高(P＜0.01),Ⅰ型前胶原mRNA表达显著降低(P＜0.01);20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之间,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,PPARγ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无显著件(P＞0.05).而各组之间的TGF-β1 mRNA的差异无显著性意义(P＞0.05).(2)Western blot:PPARγ及TGF-β1蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致.Ⅰ型胶原表达与RT-PCR Ⅰ型前胶原mRNA表达结果相一致.各组之间的Ⅲ型胶原表达差异无显著性意义(P＞0.05).(3)免疫细胞化学:20α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3 α-SMA罗格列酮组或对照组相比,α-SMA表达明显降低(P＜0.05).20 α-SMA岁格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).(4)ELISA:20 α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3α-SMA罗格列倒组或对照组相比,细胞的培养上清中Ⅰ型胶原表达明显降低(P＜0.01).20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酬组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).结论 PPAR?配体罗格列酬能够在促进PPAR?的合成表达的同时,抑制细胞的增殖及胶原合成,抑制α-SMA的表达,减少细胞分泌Ⅰ型胶原,对肝星状细胞的活化有明显的抑制作用.     

pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞(SMCs)验证hTIMP-1的表达.方法 将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs(pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组).应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染SMCs(空质粒pcDNA3.1转染组)和未转染质粒的SMCs(未转染组)作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.     

TGF-β2转染关节软骨细胞的实验研究

目的 观察人关节软骨细胞在体外单层培养过程中的去分化，以及转染TGF-β2在关节软骨细胞内的表达和对去分化的抑制作用。方法 从手术中切除的软骨组织中分离培养成人关节软骨细胞，通过脂质体介导的方法将已构建的pcDNA3.1( )/TGF-β2转染到体外单层培养的软骨细胞中，采用RT-PCR，ELISA、组织学染色、免疫组化和原位杂交的方法．分别对转染组和未转染组的第1、6、9代细胞进行检测，比较目的基因表达、软骨细胞形态以及胶原和多糖生物合成的差异．结果 经多次传代后，未转染软骨细胞在体外单层培养过程中逐渐走向去分化．TGF-β2、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚糖体的表达逐渐减低．而Ⅰ型胶原的表达增高，目的基因在转染组各代软骨细胞内均得到表达，转染后细胞保持软骨细胞的形态，Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚糖体表达虽有降低．但均高于未转染的同代细胞，而Ⅰ型胶原表达增高的程度低于未转染细胞。结论 人关节软骨细胞在体外单层培养中有去分化趋势；pcDNA3.1( )/TGF-β2真核表达载体转染人关节软骨细胞获得成功．在转染后关节软骨细胞内稳定表达．并对软骨细胞的去分化有抑制作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ1基因转染诱导肝星状细胞表型及功能的变化

目的 用慢病毒介导PPARγ1基因在HSC中过表达,观察对HSC的增殖及细胞外基质合成的影响.方法 用慢病毒质粒系统在293T细胞中包装出重组慢病毒Lent/PPARγ1并感染HSC,用RT-PCR及WB检测目的 基因及目的 蛋白的表达,用噻唑蓝(MIT)比色法观察对HSC增殖的影响,用RT-PCR观察对Ⅰ型胶原、TCFβ1表达的影响.结果 成功构建Lent/PPARγ1并感染HSC,RT-PCR及WB检测到目的 基因及蛋白的表达,MTT检测表明Lent/PPARγ1组12、96 h的A值分别为0.420±0.031、0.638±0.040,与对照组0.448±0.019、0.810±0.070比较差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测表明Lent/PPARγ1组I型胶原、TGFβ1的2-△△Ct值分别为1.496±0.359、0.667±0.153,与对照组2.602±0.301、1.008±0.102比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建携带PPARγ1的重组慢病毒载体并感染HSC,PPARγ1基因过表达可抑制HSC的增殖和活化.     

视黄醇类核内受体-α基因慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞的影响

目的:通过视黄醇类核内受体-α(retinoid X receptor-alpha,RXR-α)基因慢病毒表达载体的构建,及其对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化、增殖影响的研究,探讨RXR-α基因在肝纤维化中的作用。方法:①构建RXR-α基因慢病毒表达载体;②分离和体外培养大鼠HSC;③将自发活化的HSC分成3组,即正常对照组、阴性对照组和RXR-α载体组;分别将空白慢病毒载体和RXR-α慢病毒载体转染自体活化的HSC,采用Western印迹法检测各组细胞中RXR-α、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达变化,用MTT法检测各组HSC培养24、48、72及96 h后的增殖情况。结果:正常对照组及阴性对照组HSC中几乎没有RXR-α蛋白的表达,而RXR-α载体转染组的HSC中出现RXR-α蛋白的明显表达。与正常对照组及阴性对照组相比,RXR-α载体组转染的HSC中α-SMA蛋白表达量显著下降(t=3.767,P0.01和t=8.491,P0.05),Ⅰ型胶原蛋白表达也显著降低(t分别为10.449和10.756,P值均0.01),同时HSC的增殖能力也显著下降(t分别为4.381和1.778,P值均0.05)。而阴性对照组与正常对照组相比,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达量和HSC增殖能力无明显变化(P0.05)。结论:RXR-α基因在HSC内的增强表达能显著抑制HSC的活化和增殖,具有潜在的抑制肝纤维化的作用。     

乙型肝炎病毒X基因对肾小管上皮细胞间质转分化的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达蛋白HBX对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)细胞形态及转分化的影响.方法 用分子克隆的方法构建pcDNA3.1-myc-HBX质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,Q-PCR及Western印迹法验证HBX在HK-2细胞中的表达.以未转染质粒和转染空载质粒pcDNA3.1-myc作为对照.用显微镜观察转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒后HK-2细胞形态,用Western印迹及Q-PCR法检测细胞转分化标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达;ELISA检测细胞上清液中白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达.结果 转染HBX后的HK-2细胞中存在HBX的高表达,证实转染成功.转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒的HK-2细胞数量明显下降,细胞形态不规则,细胞状态受损;转染pcDNA3.1-myc-HBX质粒的HK-2细胞可上调E-cadherin及α-SMA表达;细胞上清液中高表达IL-1、IL-6和TNF-α(P＜ 0.01).结论 HBX质粒转染HK-2细胞后可引起细胞数目和形态的变化,并促进肾小管上皮细胞发生上皮间质转分化,肾小管上皮细胞周围炎性微环境的改变可能是其发生上皮间质转分化的原因之一.     

反义TGF-β1对周围神经生长影响的实验研究

目的 观察反义TGF-β1对大鼠坐骨神经损伤后神经纤维再生及神经功能恢复的影响. 方法 将50只成年SD大鼠随机分成3组:NS组(神经吻合术后局部注射生理盐水,20只)、反义TGF-β1组(神经吻合术后局部注射反义TGF-β1,20只)和正常对照组(不做任何处理,10只).术后6周、12周分别用免疫组化检测胶原Ⅰ、Ⅲ的表达量;显微镜下对新生神经纤维数量进行计数;应用足印分析和电生理检查技术,从功能角度判定反义TGF-β1的生物效应.结果 在6周、12周两个时相点,免疫组化结果证实,反义TGF-β1组胶原Ⅰ、Ⅲ表达低于NS组(分别为P＜0.05,P＜0.05);神经纤维计数证实,新生神经纤维数目明显优于NS组(P＜0.05);在坐骨神经功能指数测定、神经传导速度等神经功能恢复指标上,TGF-β1组优于对照组(P＜ 0.05). 结论 反义TGF-β1通过抑制胶原Ⅰ、Ⅲ的过量表达,预防神经损伤后创伤性神经瘤的形成,有利于损伤神经纤维轴索再生,使大鼠的神经功能得到了明显改善.     

氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞旁分泌活化途径的抑制作用

目的观察氧化苦参碱对大鼠激活肝星状细胞(HSC)这一旁分泌活化途径的影响.方法分离正常及CCl4损伤肝库普弗细胞(KC),进行体外培养,收集损伤肝KC条件培养液(IKCM)及药物(氧化苦参碱,Oxy)干预后的条件培养液(Oxy-IKCM),以IKCM及Oxy-IKCM添加于原代培养的未活化HSC培养体系中,观察Oxy对KC旁分泌激活HSC的影响,生物学方法检测Oxy对活化的KC分泌TGFβ1的影响.结果急性损伤肝KC对HSC的增殖有促进作用,氧化苦参碱可抑制KC对HSC增殖的促进作用,并可抑制活化KC分泌的TGFβ1.结论氧化苦参碱可通过抑制旁分泌途径抑制HSC活化及活化KC分泌的TGFβ1.