糖尿病裸鼠的皮肤组织改变及其与创面愈合的相关性

目的 研究糖尿病裸鼠的皮肤组织改变及其与皮肤创面愈合的相关性。方法 采用150 mg/kg链脲佐菌素（STZ）一次性腹腔注射建立糖尿病裸鼠模型。对正常对照组裸鼠（n=20）和诱导成模后4周的糖尿病裸鼠（n=20）分别切取背部直径为1.8 cm的全层皮肤。采用苏木精-伊红（HE）染色,观察裸鼠皮肤的组织学改变并测量真皮层和表皮层厚度。采用苦味酸天狼猩红染色并分析相对胶原含量;应用氧化酶法测量皮肤组织糖含量。于术后第3、5、7、14和21天观察创面的愈合率。结果 糖尿病组裸鼠的皮肤真皮层和表皮层厚度较正常对照组明显变薄,真皮层相对胶原含量也明显少于正常对照组,差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。糖尿病组裸鼠的血糖浓度和皮肤糖含量均高于正常对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;皮肤组织糖含量与血糖浓度呈正相关（r=0.951,P＜0.01）。糖尿病组裸鼠在术后第3、5、7、14和21天的创面愈合率显著低于正常对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 应用STZ诱导的糖尿病裸鼠模型的皮肤组织改变明显,这些改变可能与局部糖基化终末产物蓄积,导致糖尿病皮肤创面不易愈合有关。     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的 利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法 体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植+干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果 去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植+干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P<0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论 去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植＋干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植＋干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P〈0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

脂肪干细胞调节创面炎症反应并促进创面愈合

目的利用脂肪组织来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)促进创面愈合并初步探讨其机制。方法采用胶原酶消化GFP转基因小鼠(GFP-C57BL)腹股沟处脂肪组织,获得ADSCs,并在体外证明其具有成骨和成脂的多向分化能力。14只C57BL小鼠随机分为两组并制作创面,实验组注射PBS缓冲液悬浮的ADSCs,对照组注射相同体积的PBS缓冲液。观察并分析创面愈合情况,通过荧光显微镜观察移植细胞的存活情况,利用real-time PCR检测创面组织中促炎因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(TCP-1)以及抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的表达。结果分离的细胞具有较强的增殖能力,并具有多向分化潜能。同种异体移植ADSCs可以显著促进创面的愈合速度。移植两周后,荧光显微镜观察创面区域有少量ADSCs存活。与对照组相比,实验组小鼠的创面组织中促炎因子IL-1、IL-6和TCP-1表达下降,抗炎因子IL-10表达上升。结论通过同种异体局部注射ADSCs可以显著促进皮肤创面的愈合,其机制可能与AD-SCs降低了创面局部的炎症反应相关。     

脂肪间充质干细胞复合人工真皮修复大鼠深度烧伤创面的研究

目的探讨脂肪间充质干细胞（ADSCs）复合人工真皮（皮耐克）修复大鼠深度烧伤创面的作用。方法用胶原酶法消化SPF级绿色荧光蛋白转基因大鼠腹股沟脂肪,获得ADSCs,用流式细胞仪分析鉴定其表面特异性标志物,并观察ADSCs向成骨细胞、成脂细胞分化的潜能。建立大鼠深度烧伤模型,将大鼠对称的左、右创面分为实验组和对照组。实验组采用人工真皮+ADSCs治疗,对照组采用人工真皮+0.9%氯化钠注射液治疗。分别于术后7、14、21d观察创面最大直径以评估创面愈合情况,术后21d时荧光显微镜下观察创面冷冻切片评估实验组与对照组创面情况。结果成功获得大鼠ADSCs,具有较强的增殖能力及多向分化能力。ADSCs对间充质干细胞标志物CD29、CD90、CD44呈现高表达;对造血干细胞表面标志物CD34、白细胞共同抗原CD45则呈低表达。治疗后14d时,实验组创面最大直径明显小于对照组（P＜0.05）,即实验组创面愈合速度比对照组明显增快。治疗后21d,实验组创面可见散在点状绿色荧光,而对照组未观察到明显荧光。结论ADSCs联合人工真皮作用于深度烧伤创面可显著促进创面愈合,是一种有效的治疗深度烧伤的方法。     

过表达趋化因子受体2促进脂肪间充质干细胞对皮肤损伤的修复

目的 探讨过表达趋化因子受体2（CCR2）是否能促进脂肪间充质干细胞(ADSCs)皮下移植对小鼠皮肤创伤修复的效率。方法 分离培养ADSCs,取3~5代细胞通过流式细胞技术检测ADSCs相关的细胞表面标志物CD73、CD105、CD44和CD31的表达,并分别置于骨、软骨和脂肪诱导分化培养基中进行诱导分化,检测其多向分化潜能。通过慢病毒感染法构建过表达CCR2的ADSCs。在实验小鼠脊背两侧皮肤上分别制备一个面积为0.8cm×0.8cm的机械创面,随机分成3组,分别皮下注射CCR2-EGFP-ADSCs、EGFP-ADSCs和磷酸盐缓冲液（PBS）到小鼠创面4周。每天记录创面愈合情况,并进行病理切片观察,与对照组对比分析。结果 分离培养的ADSCs高表达CD73、CD105和CD44,不表达CD31,具有骨、软骨、脂肪诱导分化潜能。过表达CCR2的ADSCs构建成功。小鼠皮肤创伤造模及移植细胞后,各组小鼠均存活,创面逐日缩小。CCR2-EGFP-ADSCs组、EGFP-ADSCs组和对照组第5、9天的创面愈合率分别为(68±3.1)%和(91±2.1)%、(63±2.7)%和(87±2.1)%、(58±3.5)%和(80±2.9)%。注射了ADSCs的两组愈合率均显著高于对照组（均P<0.05）。病理组织切片显示3组小鼠第9天创面真皮层较正常皮层均有增厚,且CCR2-EGFP-ADSCs组观察到明显的类毛囊结构,多于EGFP-ADSCs组,对照组未观察到类似结构。结论 过表达CCR2可促进ADSCs对皮肤损伤的修复。     

小鼠脂肪间质干细胞源胞外囊泡激活蛋白激酶B促进卵巢癌细胞增殖迁移和上皮间质转化

目的:探讨小鼠脂肪间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)源胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对卵巢癌ID8细胞株生物功能的影响及其可能机制。方法:采用酶消化法分离获得ADSCs,利用其形态特征、成骨成脂多向分化能力和流式细胞术表面标志检测对ADSCs进行鉴定;采用超速离心法从ADSCs上清液中分离和纯化EVs(ADSC-EVs),并通过透射电子显微镜、纳米粒径分析和蛋白质印迹实验进行鉴定;以PBS作为对照组,实验组采用不同浓度ADSC-EVs(20 μg/mL和40 μg/mL)分别预处理ID8细胞,通过平板克隆实验检测ADSC-EVs对ID8细胞增殖能力的影响;划痕实验和Transwell实验检测ADSC-EVs对ID8细胞迁移能力的影响;蛋白质印迹实验检测ID8细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和蛋白激酶B(即AKT)相关蛋白的表达。结果:分离的ADSCs具有典型的干细胞形态,能够向成骨成脂分化,并符合干细胞表面一般特征;ADSC-EVs表达CD9和CD81蛋白;与PBS组相比,ADSC-EVs组ID8细胞增殖和迁移能力明显增强(P均＜0.05),且40 μg/mL ADSC-EVs组细胞增殖和迁移能力较20 μg/mL ADSC-EVs组明显增强(P均＜0.05);随着ADSC-EVs浓度增加,ID8细胞E-钙黏蛋白表达明显降低,N-钙黏蛋白、波形蛋白和p-AKT表达明显增加(P均＜0.05)。结论:ADSC-EVs可能通过激活AKT信号的磷酸化促进ID8细胞EMT,进而增强其增殖和迁移能力。     

siRNA特异性沉默ADP核糖基化因子6对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究ADP核糖基化因子6（Arf6）对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响并初步探讨 其可能的分子作用机制。方法设计合成3条针对不同靶向区域的Arf6特异性siRNA序列,转染细胞后通过real-time PCR和 蛋白质印迹法检测其对Arf6的干扰效果,筛选出干扰效果最佳的siRNA序列;通过噻唑盐（MTT）实验、划痕实验、及transwell 细胞迁移和侵袭实验观察siRNA干扰Arf6表达对PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响;蛋白质印迹法检测AKT、p-AKT、ERK1/ 2、p-ERK1/2和Rac1蛋白表达水平的变化。结果与空白对照组相比,转染阴性对照序列对PC-3细胞内源性Arf6的mRNA和 蛋白表达水平无明显影响,3 条siRNA 序列均能抑制Arf6 的表达,其中siRNA-3 对PC-3 细胞Arf6 表达干扰效果最好,Arf6 mRNA和蛋白抑制率分别为（91.88±3.13）%和（86.37±0.57）%。siRNA-3干扰Arf6表达抑制PC-3细胞的增殖,且PC-3细胞体外 迁移距离和侵袭细胞数较空白和阴性对照组明显减少（P<0.05）。蛋白质印迹法检测发现转染siRNA-3的PC-3细胞p-ERK1/2 和Rac1表达水平明显降低,而AKT、p-AKT和ERK1/2表达水平较对照组差异无统计学意义。结论siRNA干扰Arf6表达可显 著抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其分子作用机制可能与p-ERK1/2和Rac1表达下调相关。     

山茶花提取物抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的 探究山茶花提取物通过调控miR-526b-3p的表达抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法 收集对数期SW1088细胞,用浓度为30、60、120 mg/L的山茶花提取物处理细胞,分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组,以正常培养SW1088细胞作为对照组;按照脂质体法将miR-NC、miR-526b-3p转染至SW1088细胞中分别记为miR-NC组、miR-526b-3p组;将anti-miR-NC、anti-miR-526b-3p转染至SW1088细胞中,并加入高剂量山茶花提取物分别记为anti-miR-NC+高剂量组、anti-miR-526b-3p+高剂量组。MTT、Transwell分别检测细胞增殖活性和细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测细胞周期素D1（CyclinD1）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、磷酸化的PI3K（p-PI3K）、磷酸化的AKT（p-AKT）蛋白表达水平;qRT-PCR检测miR-526b-3p相对表达量。结果 山茶花提取物或过表达miR-526b-3p可降低胶质瘤细胞SW1088增殖活性,同时降低细胞迁移数量、侵袭数量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平,增加miR-526b-3p相对表达量。此外,高剂量组可降低SW1088细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白水平。抑制miR-526b-3p可减弱山茶花提取物对胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭以及PI3K/AKT信号通路的影响。结论 山茶花提取物可能通过调控miR-526b-3p/PI3K/AKT信号通路抑制胶质瘤细胞SW1088增殖、迁移和侵袭     

人脂肪干细胞分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用

目的：分离培养脂肪干细胞（ADSCs）以探讨其分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用.方法：从人腹部脂肪组织中分离并培养ADSCs3d后,ELISA法测定ADSCs分泌血管内皮生长因子（VEGF）,肝细胞生长因子（HGF）含量;收集ADSCs培养液（ADSC-CM）作用于HaCaT细胞株.采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定HaCaT细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果：培养获得ADSCs细胞3d后,培养液中VEGF、HGF含量分别为（287±47）,（577±85）ng/L.MTT实验30%ADSC-CM组、50%ADSC-CM组的A490nm值分别高于对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）.实验组HaCaT细胞凋亡率明显低于对照组（P〈0.05）.与对照组相比较,实验组HaCaT细胞迁移距离36,48h时间点显著增大（P〈0.05或P〈0.01）.结论：ADSCs能分泌细胞因子且对HaCaT细胞具有促增殖、迁移和抑制凋亡作用.     

负压创面治疗术对大鼠脂肪干细胞迁移行为的影响

目的 探讨负压创面治疗术(NPWT)对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)迁移行为的影响.方法 8头体质量为(20士2)kg巴马小香猪,分别接受假手术(A组,n=16)、持续负压吸引(B组,n=8)和间歇负压吸引(C组,n=8),治疗72 h后观察3个月.细胞水平观察NPWT对ADSCs迁移行为的影响,提取大鼠ADSCs,采用8h持续负压吸引和间歇负压作用于ADSCs,Tran-swell检测ADSCs迁移能力,MTT检测细胞增殖能力,Western blot法检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达.结果 B组和C组创面愈合效果明显优于A组;与A组比较,B、C组ADSCs细胞迁移数量差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),而细胞增殖差异均无统计学意义(P＞0.05);HIF-1α表达与ADSCs细胞迁移结果一致.结论 NPWT通过上调HIF-1α蛋白表达进而促进大鼠ADSCs迁移.     

IL-23促进食管鳞状细胞癌细胞上皮间质转化和迁移

［摘要］目的: 探讨外源性IL-23通过PI3K/AKT/c-Myc通路对TE-1细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和迁移的影响。方法: 采用免疫组织化学和免疫荧光检测12例食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者癌组织与配对癌旁组织中IL 23及其受体(IL 23R)的表达和胞内定位;蛋白质印迹检测TE 1细胞与阴性对照NIH3T3细胞中IL-23p19表达,流式细胞术检测IL-23R的表达;PCR和蛋白质印迹法检测空白对照组,50 ng/mL IL-23组,1 μmol/L Wortmannin +50 ng/mL IL-23组细胞中c-Myc mRNA及其蛋白与E 钙黏蛋白、波形蛋白、p-AKT、Snail 1、Slug蛋白的表达;划痕和Transwell实验检测各组TE-1细胞侵袭和迁移能力。结果： 与癌旁组织比较,ESCC组织及其细胞质中IL-23呈高表达,细胞膜上IL-23R高表达;与阴性对照比较,TE 1细胞中IL-23p19及IL-23R呈过表达（P均<0.01）;与对照组比较,IL-23组细胞中c-Myc mRNA及其蛋白、p-AKT、波形蛋白、Snail 1、Slug蛋白明显升高,E 钙黏蛋白表达明显降低,TE-1细胞划痕愈合率和迁移数明显升高(P均<0.05)。与IL-23组比较,IL-23+Wortmannin组细胞中c Myc mRNA及其蛋白、p-AKT、波形蛋白、Snail 1、Slug蛋白明显降低,E-钙黏蛋白明显升高,TE-1细胞划痕愈合率和迁移数明显降低(P均<0.05)。结论： IL-23通过PI3K/AKT/c-Myc通路促进食管鳞癌细胞上皮间质转化和迁移。     

同种异体富血小板血浆提取液对脂肪干细胞的体外促增殖作用

目的：观察不同浓度同种异体富血小板血浆(PRP)提取液对脂肪干细胞(ADSCs)体外增殖的影响,为将同种异体PRP提取液应用于创面修复提供实验依据。方法：取SD大鼠腹股沟脂肪组织进行原代及传代培养;通过将获得的细胞向脂肪、骨和神经方向诱导分化,鉴定其干细胞特性;三次离心法制备同种异体PRP提取液,加入DMEM/F12配制成6.67%、3.35%和1.67%的培养液;将第3代ADSCs分为4组：实验组(A、B和C组)分别以含体积分数为6.67%、3.35%和1.67%PRP提取液的培养液培养,对照组(D组)ADSCs用仅含10%胎牛血清、DMEM/F12的基础培养液培养;在培养24和48 h后采用MTT法观察ADSCs生长状态。结果：原代培养成功获得贴壁生长细胞,呈成纤维细胞样,并成功向脂肪细胞、骨细胞和神经细胞方向诱导分化,即具有多向分化潜能,证明所培养的细胞为ADSCs;酶标仪测定,A、B、C、D组在培养24 h后吸光度(A)值分别为0.434 3±0.084 3、0.351 6±0.076 6、0.258 1±0.060 0和0.259 2±0.073 6,在培养48 h后A值分别为 1.016 8±0.443 6、0.741 7±0.109 7、0.367 8±0.034 2和0.395 7±0.106 2; A组和B组的A值均高于C组和D组(均P<0.05);A 组的A值高于B组(P<0.05);C组A值与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。A和B组细胞增殖率明显升高,而C组细胞增殖率呈负增长。结论：适当浓度的同种异体PRP提取液可显著促进ADSCs体外增殖,有望应用于创面修复。     

胰岛素样生长因子-1促进脂肪干细胞迁移能力的研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）对脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）迁移能力的影响,为勃起功能障碍的治疗建立实验基础。方法 采用酶消化法分离提取SD大鼠皮下脂肪干细胞,以含有10%的胎牛血清的DMEM培养基培养。通过流式细胞仪检测ADSCs表面标志物（CD34、CD44、CD45）的表达情况。采用终浓度为20ng/ml IGF-1预处理ADSCs,观察IGF-1对ADSCs迁移能力以及CXCR4蛋白的表达情况。结果 流式细胞术显示ADSCs的表型分子CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性。IGF-1可上调CXCR4的表达,并且促进 ADSCs向SDF-1迁移。结论 本实验成功分离培养ADSCs,IGF-1能够提高ADSCs表面CXCR4蛋白的表达,从而促进ADSCs迁移,并为下一步将IGF-1预处理的ADSCs应用于大鼠体内勃起功能障碍的治疗提供基础。     

siRNA 沉默胸腺素β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

目的：利用 siRNA 干扰技术研究胸腺素β4（Tβ4）基因沉默对鹿茸间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法鹿茸 MCS 分为阴性对照组、siRNA-Tβ4转染组2组。MTT 检测 MSC 增殖的变化,Real-time PCR 检测 ILK、AKT 及 CyclinD1 mRNA 表达量差异变化,Western blot 检测 AKT 及 P-AKT 蛋白含量变化。结果 siR-NA-Tβ4转染组 MSC 增殖受到显著抑制（P ＜0.01）;siRNA-Tβ4转染组 ILK、CyclinD1 mRNA 表达量下调,AKT mRNA 表达量不变;siRNA-Tβ4转染组总 AKT 蛋白含量无变化,P-AKT 蛋白含量减少。结论 Tβ4基因沉默能显著抑制 MSC 增殖,并可能通过下调 ILK、P-AKT 及细胞周期相关蛋白 CyclinD1从而抑制 MSC 细胞增殖。     

脐带间充质干细胞治疗2型糖尿病皮肤溃疡的临床研究

目的探讨脐带间充质干细胞移植治疗2型糖尿病皮肤溃疡的临床效果。方法选取我院2012—2013年收治的2型糖尿病皮肤溃疡患者100例为研究对象,随机分为对照组、观察组各50例。对照组2型糖尿病皮肤溃疡患者行常规换药,观察组患者应用脐带间充质干细胞移植治疗。治疗后,比较二组患者愈合时间及愈合效果。结果观察组的显效时间和愈合时间均较对照组显著缩短,差异具有统计学意义（P〈0.05）。观察组的治愈率显著高于对照组（P〈0.05）,观察组的总有效率显著高于对照组。结论脐带间充质干细胞移植较单用及常规治疗方法更好地改善2型糖尿病皮肤溃疡创面的愈合,避免患者组织感染,提高压疮患者的生活质量。