B细胞活化因子B7—1cDNA的克隆及其在白血病细胞的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从ＥＢＶ转化Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ、酶切Ｂ７－１基因和逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，连结、克隆ＰＬＢ７－１ＳＮ到大肠杆菌Ｍｃ１０６１。扩增纯化质粒ＰＬＢ７－１ＳＮ。用ＰＡ３１７细胞包装病毒，ＮＩＨ３Ｔ３细胞筛查病毒滴度，获得高效价的Ｂ７－１病毒上清，病毒感染人白血病细胞株Ｋ５６２和ＨＬ６０，获得稳定表达Ｂ７－１分子的肿瘤细胞。     

神经营养因子—3在成年大鼠胃和睾丸分布的研究

用特异的神经营养因子－３（ＮＴ－３）兔抗血清，以免疫组化ＡＢＣ法染片观察了ＮＴ－３样免疫反应物（ＮＴ－３－ＩＲ）在成年大鼠胃和睾丸的分布。结果：ＮＴ－３－ＩＲ主要分布于胃的部分上皮细胞、壁细胞、主细胞和平滑肌细胞。阳性产物的亚细胞定位除胞浆外，亦有细胞核内染色；ＮＴ－３－ＩＲ在睾丸主要分布于曲精小管上皮的部分各级生精细胞，阳性染色位于细胞浆。结果提示：ＮＴ－３可能与胃和睾丸的某些生理功能有关，且两者发挥功能的方式可能有异。     

重组人GM-CSF-IL_3融合蛋合(G_3)单克隆抗体的研制和鉴定

用重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子－白细胞介素３（ｒｂＧＭ－ＣＳＦ－ＩＬ３）融合蛋白（Ｇ３）作为免疫原．通过Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术建立了两株稳定分泌抗ｒｈＧＭ－ＣＳＦ－ＩＬ３（Ｇ３）单克隆抗体的杂交瘤细胞株．分别命名为ＭＧ３１和ＭＧ３２。经鉴定，两种单抗均为小鼠ＩｇＧ１亚类。其染色体众数分别为９１和８６．并能特异地识别分子量约３０ＫＤ的Ｇ３。ＭＧ３１和ＭＧ３２经３个月传代培养及冻存复苏．在培养沿及Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹水中均能产生而滴度抗体。抗Ｇ３单克隆抗体的获得为深入研究Ｇ３的亲和层析纯化、Ｇ３的免疫学测定及其生物学特性提供了必要的条件。     

慢性乙肝患者血浆中C3d和SC5b—9的检测及其意义

目的：探讨慢性乙肝患者血浆Ｃ３ｄ和ＳＣ５ｂ－９变化的意义。方法：以ＥＬＩＳＡ双抗夹心法测定３６例ＣＰＨ患者、３９例ＣＡＨ患者及正常对照组血浆Ｃ３ｄ和ＳＣ５ｂ－９含量，并测定补体系统活化的其他有关指标。结果：①ＣＰＨ及ＣＡＨ患者Ｃ３ｄ含量及Ｃ３ｄ／Ｃ３的比值均大于正常对照组，ＣＨ５０、Ｃ３、Ｃ４和ＢＦ水平均小于正常对照组，ＣＡＨ患者ＳＣ５ｂ－９含量大于正常对照组。②ＣＡＨ患者Ｃ３ｄ、ＳＣ５ｂ－９含量     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

应用PCR检测HL－60细胞诱导分化前后c－myc癌基因的扩增

应用ＰＣＲ方法研究了维甲酸（ＲＡ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ基因扩增的变化。结果：ＨＬ－６０细胞内ｃ－ｍｙｃ基因扩增为１１，经ＲＡ诱导６ｄ后，其扩增程度无明显变化，而ＤＭＳＯ诱导３ｄ后，ｃ－ｍｙｃ基因扩增出现下降，至５ｄ，较未诱导分化前下降约３０％。提示了ＲＡ和ＤＭＳＯ对ＨＬ－６０细胞不同的诱导分化机制。     

应用PCR检测HL—60细胞诱导分化前后c—myc癌基因的扩增

应用ＰＣＲ方法研究了维甲酸（ＲＡ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中ｃ－ｍｙｃ基因扩增的变化。结果：ＨＬ－６０细胞内ｃ－ｍｙｃ基因扩增为１１，经ＲＡ诱导６ｄ后，其扩增程度无明显变化，而ＤＭＳＯ诱导３ｄ后，ｃ－ｍｙｃ基因扩增出现下降，至５ｄ，较未诱导分化前下降约３０％。提示了ＲＡ和ＤＭＳＯ对ＨＬ－６０细胞不同的诱导分化机制。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）感染的Ｃ６／３６细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ为模板,进行Ｄ２－４３株ＮＳ３基因ｃＤＮＡ片段的反转录－ＰＣＲ扩增,片段长度为１１７６ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆到Ｔ载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｋｓⅡ中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

慢性乙肝患者血浆中C_（3）d和SC_（5b－9）的检测及其意义

目的：探讨慢性乙肝患者血浆Ｃ３ｄ和ＳＣ５ｂ－９变化的意义。方法：以ＥＬＩＳＡ双抗夹心法测定３６例ＣＰＨ患者、３９例ＣＡＨ患者及正常对照组血浆Ｃ３ｄ和ＳＣ５ｂ－９含量，并测定补体系统活化的其他有关指标。结果：①ＣＰＨ及ＣＡＨ患者Ｃ３ｄ含量及Ｃ３ｄ／Ｃ３的比值均大于正常对照组，ＣＨ５０、Ｃ３、Ｃ４和ＢＦ水平均小于正常对照组，ＣＡＨ患者ＳＣ５ｂ－９含量大于正常对照组。②ＣＡＨ患者Ｃ３ｄ、ＳＣ５ｂ－９含量及Ｃ３ｄ／Ｃ３的比值均大于ＣＰＨ患者，ＣＨ５０含量小于ＣＰＨ患者。③ＣＡＨ患者ＳＣ５ｂ－９与Ｃ３ｄ、ＣＨ５０分别是正、负相关，且与ＡＬＴ水平呈正相关。结论：测定血浆Ｃ３ｄ、ＳＣ５ｂ－９含量及Ｃ３ｄ／Ｃ３的比值有助于临床上对慢性乙肝病情和预后作出判断。进一步了解ＭＡＣ在肝细胞的存在情况，有助于加深对慢性乙肝发病机理的认识。     

柯萨奇B3病毒诱导鼠心肌炎血浆β-内啡肽及其受体的变化

目的：观察病毒性心肌炎病毒过程中内源性阿片系统激活的动态变化,探讨阿片肽在心肌炎病理损伤中的作用。方法：以柯萨奇Ｂ３病毒（Ｃｏｘ Ｂ３）诱导ＢＡＬＢ／ｃ鼠心肌炎为实验模型,观察感染后第３,７,１０,１５,２５和３５ｄ鼠体、肝和肺的质量,血浆β－内啡肽（β－ＥＰ）水平、心肌细胞β－ＥＰ受体及心肌病损程度。采用放射免疫法测定血浆β－ＥＰ、放射与配体结合法测定β－ＥＰ受体、常规病理检查心肌病损程度。结果     

双亚基共表达人白细胞介素12重组腺病毒载体的构建与应用

目的构建双亚基共表达人白细胞介素１２（ＩＬ－１２）重组腺病毒载体,为其临床研究提供实验基础。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ分别克隆出人ＩＬ－１２两个亚基ｐ４０和ｐ３５的全长编码ｃＤＮＡ,经脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点（ＩＲＥＳ）序列连接后置于ＣＭＶ启动子下游,将其插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ,构建成人ＩＬ－１２的双顺反子共表达重组腺病毒载体;与ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞,经同源重组制备人ＩＬ－１２的重组腺病毒。结果扩增到的人白介素１２重组腺病毒滴度为２．１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ,体外感染２９３细胞、ＨｅｐＧ２细胞和人原代皮肤成纤维细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测证实人ＩＬ－１２的表达（３０～５０ｎｇ／１０６细胞／２４小时）,所表达的ＩＬ－１２体外能刺激人淋巴母细胞的增殖和ＩＦＮ－γ的产生。结论所制备的人ＩＬ－１２双亚基共表达重组腺病毒载体能有效表达具有生物学活性的人ＩＬ－１２,可望进一步用于临床研究。     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

在结肠癌细胞内高效表达内皮抑素的增殖型腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒载体,寻找结肠癌的有效治疗方法.方法:通过RT-PCR克隆内皮抑素基因,293细胞内分别重组携带内皮抑素基因的增殖型(CNHK200-hE)和增殖缺陷型(Ad-hE)腺病毒,分别体外感染结肠癌细胞HT-29后比较两者在细胞病理效应、病毒增殖和内皮抑素表达量方面的差异.结果:CNHK200-hE感染结肠癌细胞96 h后可增殖2 000多倍;感染后7 d肿瘤细胞死亡率达96.2%,而对正常肝细胞基本无杀伤作用;随着感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,第5天达1 090 ng/ml,显著高于Ad-hE感染组(P<0.01).结论:携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒CNHK200-hE具有高效表达内皮抑素和在结肠癌细胞内增殖并杀灭肿瘤细胞的作用.     

Construction and identification of recombinant adenovirus-mediated gene transfer system for rat vascular endothelial growth factor

Objective To construct the recombinant adenovirus vector carrying rat vascular endothelial growth factor(VEGF), as preparation for genetic transfection that follows. Methods Rat VEGF was obtained by using RT-PCR amplification and then cloned into the shutter plasmid pDC316. Subsequently, this newly constructed plasmid pDC316-VEGF, after identification by nuclease digestion analysis and sequencing analysis, was transfected into human embryonic kidney cells HEK293 by Lipofectamine 2000 mediation, together with adenovirus-packaging plasmid pBHGE3. Based on the homologous recombination of the two plasmids within HEK293 cells, the recombinant adenovirus vector carrying VEGF and VDC316-VEGF was created. VDC316-VEGF was subsequently identified using PCR, purified using repeated plaque passages, proliferated using freezing and melting within HEK293 cells, and titrated using 50% Tissue Culture Infective Dose(TCID50) assay. ResultsThe newly constructed recombinant adenovirus was confirmed to carry rat VEGF based on PCR results, and its titration value determined based on TCID50 assay was 3×109 pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus carrying rat VEGF was successfully constructed. The newly constructed adenovirus can produce a sufficiently high titration value within HEK293 cells, providing a reliable tool for genetic transfection in further gene therapy researches.     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

NME1重组腺病毒构建及表达鉴定

目的：应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为10^10 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。