人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

hS100A6抑制卵巢癌细胞HO8910和HO8910 PM增殖、促进凋亡并上调其Wnt/β-catenin活性

目的研究hS100A6(human S100A6)对人卵巢癌细胞系(低转移系HO8910和高转移系HO8910 PM)增殖、凋亡和Wnt/β-catenin信号途径的影响。方法通过MTT以及台盼蓝染色检测细胞增殖的变化;Hoechst检测细胞凋亡的变化;提取细胞总蛋白及核蛋白Western blot检测hS100A6对β-catenin的影响。结果 MTT及台盼蓝染色结果显示hS100A6抑制HO8910细胞和HO8910 PM细胞的增殖(P<0.05),Hoechst染色结果显示hS100A6同时促进这两系细胞的凋亡(P<0.05);Western blot显示hS100A6增加β-catenin的水平并促进其发生核转位。结论 hS100A6能抑制人卵巢癌细胞系HO8910和HO8910 PM增殖,促进其凋亡,同时激活Wnt/β-catenin信号途径。     

S100A4上调表达对HBL-100和MCF-7细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨S100A4对人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移、侵袭和凋亡以及对这两种细胞中的Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号途径的影响.方法 用表达S100A4的重组腺病毒(AdS100A4)感染细胞,采用MTT、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验和Hoechst染色分别检测细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡活性的变化;同时通过PCR和Western blot检测S100A4对两种细胞中Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号途径的影响.结果 (1)HBL-100和MCF-7细胞在第4天的增殖分别增加53.3％和59.1％ (P ＜0.05);24 h的划痕愈合率分别增加73.6％和64.8％(P＜0.05);S100A4对HBL-100的穿膜细胞数无明显影响(P＞0.05),但使MCF-7的穿膜细胞数增加1倍(P＜0.05);HBL-100和MCF-7细胞在48 h的凋亡率分别减少约30％和36％(P＜0.05);(2)感染AdS100A4后的HBL-100和MCF-7细胞中β-catenin较GFP组分别增加49％和55％(P＜0.05);尽管两种细胞中t-GSK3β无显著改变,但是其p-GSK3β却较GFP组分别增加73％和55％(P＜0.05),c-Myc的表达量分别增加38％和30％ (P ＜0.05);(3) S100A4对HBL-100中的t-JNK、p-JNK和c-Fos的mRNA以及MCF-7细胞的t-JNK的水平均无影响,但是,却致MCF-7中的p-JNK增加39％(P＜0.05),c-Fos的mRNA增加32.3％ (P ＜0.05).结论 S100A4可促进HBL-100和MCF-7细胞的增殖、迁移,并抑制这两种细胞的凋亡;增强MCF-7细胞的侵袭能力.S100A4可增强HBL-100和MCF-7细胞中的Wnt/β-catenin信号途径活性以及MCF-7细胞中的Wnt/JNK信号途径活性.     

外源性S100A8在体外抑制HeLa细胞的增殖和侵袭

目的探讨外源性S100A8对宫颈癌细胞系HeLa的增殖、凋亡、克隆形成及迁移和侵袭的影响。方法 MTT法检测细胞增殖活性;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞技术检测细胞周期;平板集落形成实验检测细胞集落形成;划痕和Transwell侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭。结果细胞培养3 d时,浓度为100、300和1 000 mg/L的GST-hS100A8组的A值较GST组减少13.64%、19.29%和25.06%(P<0.05);在浓度为100 mg/L时,GST-hS100A8组呈时间依赖性减少(P<0.05);GST-hS100A8组在第3天时细胞凋亡率较GST组增加5.18倍(P<0.05),同时,出现峰值为(19.9±0.76)%的凋亡峰,而对照组没有凋亡峰;GST-hS100A8组的集落形成率较GST组减少30.2%(P<0.005);划痕愈合率较GST组降低30.1%(P<0.05);穿膜细胞数减少48.9%(P<0.05)。结论外源性S100A8可能具有抑制宫颈癌的作用。     

S100A6通过PI3K/Akt信号通路促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移

 目的：研究PI3K/Akt信号通路在S100A6介导的人骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移中的作用。方法：首先制备重组的人S100A6蛋白（recombinant human S100A6, rhS100A6）;rhS100A6与PI3K抑制剂（LY294002和wortmannin）单独或同时处理143B细胞,其中rhS100A6的终浓度为30 mg/L,LY294002和wortmannin的终浓度分别为10 μmol/L和05 μmol/L;采用Western blotting分析143B细胞中PI3K/Akt信号通路相关分子总Akt（total Akt, t-Akt）及磷酸化Akt（phosphorylation of Akt, p-Akt）蛋白的表达变化,MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。 结果：（1）成功制备rhS100A6蛋白,rhS100A6显著增强143B细胞的增殖和迁移能力（P<005）;（2）rhS100A6上调143B细胞中Akt的磷酸化;（3）与rhS100A6组相比,rhS100A6与LY294002或wortmannin联合处理组143B细胞的p-Akt减少（P<005）,细胞的增殖和迁移能力降低,在不同时点细胞的增殖率下降103%～697%,细胞迁移率下降379%～416%,差异均有统计学意义（P<005）。 结论：S100A6促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移的作用至少部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。     

桔梗提取物木犀草素联合磺胺嘧啶银治疗浅Ⅱ度烫伤作用研究

探讨桔梗成分木犀草素与磺胺嘧啶银联合治疗浅Ⅱ度烫伤的协同作用，为优化治疗方案 提供新的理论基础。方法 构建SD大鼠浅Ⅱ度烫伤模型，依据给药情况分为五组：A组为模型组，B组为 磺胺嘧啶银组，C组为木犀草素组，D组为磺胺嘧啶银和木犀草素联用组，N组为正常对照组。根据给药 第4天和第7天的创面愈合率评价不同给药组的疗效。通过测量大鼠烫伤区域伤口直径，采用苏木精-伊 红（HE）染色观察创面皮肤组织的病理变化，采用Western blot检测大鼠创面皮肤组织血管内皮生长因子 （VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和Ⅰ型胶原蛋白（Coll-Ⅰ）表达，采用ELISA检测大鼠的肿瘤 坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）水平。结果 B组、C组第7天烫伤创面愈合率均高于A组 （P＜0.05）；D组第7天烫伤创面愈合率均高于A组、B组、C组（P ＜0.05）。D组皮肤层完整，角质层、表 皮和真皮结构正常，皮肤毛囊及附属结构基本完整，恢复程度优于B组和C组。B组、C组VEGF、Coll-Ⅰ 水平高于A组，MMP-2水平低于A组（P ＜0.05）；B组和C组VEGF、Coll-Ⅰ、MMP-2水平比较，差异 无统计学意义（P ＞0.05）；D组VEGF、Coll-Ⅰ水平均高于A组、B组、C组，MMP-2水平均低于A组、B 组、C组（P ＜0.05）。B组、C组TNF-α水平均低于A组（P ＜0.05）；B组、C组TNF-α水平比较，差异 无统计学意义（P＞0.05）；A组、B组、C组IL-10水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；D组TNF-α 水平均低于A组、B组、C组，IL-10水平均高于A组、B组、C组（P ＜0.05）。结论 磺胺嘧啶银联合木犀 草素治疗浅Ⅱ度烫伤的效果优于单独用药，其潜在机制之一可能是通过下调MMP-2表达，上调VEGF、 Coll-Ⅰ和IL-10表达，抑制TNF-α等因子的表达，以减轻组织炎症，改善烫伤创面皮肤组织环境，促进 愈合。     

外源性S100A8在体外抑制HeLa细胞的增殖和侵袭

目的 探讨外源性S100A8对宫颈癌细胞系HeLa的增殖、凋亡、克隆形成及迁移和侵袭的影响.方法 MTT法检测细胞增殖活性;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞技术检测细胞周期;平板集落形成实验检测细胞集落形成;划痕和Transwell侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭.结果细胞培养3d时,浓度为100、300和10...     

GST-hS100A9融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的制备GST-hS100A9融合蛋白。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增获取hS100A9基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-hS100A9;后者转化BL21菌后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达融合蛋白GST-hS100A9,经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(GS4BB)分离纯化、SDS-PAGE及Western blot鉴定,BCA法蛋白定量,CCK-8测定GST-hS100A9对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用。结果经酶切、测序分析证实pGST-hS100A9质粒构建正确;重组菌株经IPTG诱导后,表达相对分子质量约36 000的蛋白;纯化后纯度达94%;该蛋白可被S100A9的抗体特异识别;该蛋白产量约为20 mg/L菌液;且其抑制MCF-7的增殖。结论成功构建GST-hS100A9融合蛋白的原核表达质粒pGST-hS100A9;该质粒可在BL21中诱导表达GST-hS100A9,产率高,且对MCF-7增殖有抑制作用。