PTEN基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含PTEN基因的重组腺病毒载体,为PTEN进行肺腺癌的基因治疗奠定基础。方法用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断和PSUCMV的大片断,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果经双酶切和PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,TCID_（50）法测定病毒滴度为1.0×10^10pfu/ml。结论成功构建了含PTEN基因的重组腺病毒载体Ad-PTEN,为下一步体内外实验证实PTEN对肺癌的抑制作用研究打下基础。     

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体,获得hIL-24重组腺病毒子,为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板,PCR扩增hIL-24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24,与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子,RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确,RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack,CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

大鼠TP73基因重组腺病毒载体构建及鉴定

中枢神经系统疾病如脑血管病、神经变性病、遗传性疾病等,目前均缺少有效的治疗手段,干细胞治疗成为潜在价值较高的治疗方法。但干细胞治疗目前存在较多问题,虽然局灶性脑缺血干细胞移植后可以增强内源性的神经再生、血管再生及轴突出芽及突触的形成[1,2],然而能够替代损伤区凋亡的神经元的比例却很少[2]。     

重组人hSERCA2a基因腺病毒载体构建和包装

目的：构建携带人肌浆网钙 ATP酶2 a（SERCA2 a）基因重组腺病毒载体,获得重组腺病毒 rAd-SER-CA2a-EGFP,为进一步在细胞和动物水平研究 SERCA2a基因的功能奠定基础。方法根据细菌内同源重组的方法,使用AdEasy腺病毒包装系统将人SERCA2a基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒pshuttle-CMV中,腺病毒穿梭质粒 pshuttle-CMV-SERCA2a线性化后与腺病毒载体 pAdEasy发生同源重组,通过脂质体共转染 HEK293细胞,产生重组腺病毒rAd-SERCA2 a,DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。结果通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体 pAdEasy-SERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定扩增出2998 bp的目的条带,rAd-SERCA2a-EGFP滴度高达1×10^12μg/mL。结论成功构建和包装携带 hSERCA2a 基因的 rAd-SERCA2a-EGFP,为 SERCA2a基因治疗心力衰竭动物实验及临床试验研究奠定基础。     

人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的: 构建超极化激活环核苷酸门控通道基因(HCN4)重组腺病毒载体. 方法: 采用基因工程技术,将HCN4 cDNA定向克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中,利用pAdeasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果: 测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体,病毒滴度达2.0×1015pfu/L. 结论: 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

Rac1及其突变体重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠Rac1及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N腺病毒表达载体,并制备出病毒,为进一步研究Rac1在间充质干细胞（MSCs）迁移中的作用奠定基础。方法以pMD-19-T-Rac1、pMD-19-T-Rac1Q61L、pMD-19-T-Rac1G12V、pMD-19-T-Rac1T17N为模板,扩增Racl及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-Rac1及其突变体重组质粒,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体,经PacI线性化后转染QBI-293A细胞包装病毒,收获腺病毒重组病毒子,检测病毒滴度并进行间充质干细胞病毒感染复数的鉴定。结果测序结果显示,Racl及其突变体Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N序列正确,成功包装出重组病毒子后经2～3次扩增得到约为107pfu/ml高效价重组病毒子,感染间充质干细胞后发现150 MOI为最适病毒感染复数。结论成功构建了Racl及其突变体重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1Q61L、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1G12V、pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Rac1T17N,获得了Racl重组病毒子Ad-Rac1、Ad-Rac1Q61L、Ad-Rac1G12V、Ad-Rac1T17N。     

PML重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的：构建携带PML目的基因的重组腺病毒载体（Ad-pml）。方法：应用基因重组技术将PSG-CMV和PSG5-PML分别用EcoRI和BglII双酶切,构建PSG-PML载体。将质粒PSG-PML与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3共转染至293细胞,产生含PML基因的重组腺病毒（Ad-pml）,并经PCR及DNA测序鉴定。结果：经PCR反应可扩增出1767bp大小的片段,测序结果检测Ad-pml序列正确,通过免疫荧光反应证明病毒包装成功并且具有感染力。结论：成功构建了重组腺病毒载体（Ad-pml）,为研究肿瘤基因治疗提供了基础。     

鼠IFN-λ2腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体。方法:用人水疱口炎病毒诱导小鼠原代脾细胞表达IFN-λ2,通过RT-PCR获取IFN-λ2 cDNA,将其亚克隆至pShuttle-CMV载体,经PmeⅠ线性化后,与腺病毒的骨架载体pAdEasy在BJ5183菌中同源重组,转染293A细胞包装扩增,RT-PCR检测重组腺病毒的目的基因,TCID50法对构建的腺病毒进行滴度测定。用鼠IFN-λ2重组腺病毒感染小鼠肺腺癌细胞,蛋白质印迹法检测细胞中IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜观察鼠IFN-λ2重组腺病毒对鼠肺腺癌细胞生长的抑制作用。结果:成功克隆鼠IFN-λ2的cDNA,序列与基因库公布序列完全一致;经酶切鉴定表明成功构建鼠IFN-λ2重组腺病毒载体;重组腺病毒载体在293A细胞中成功包装及扩增;包装成功的重组腺病毒中含有目的基因,病毒滴度为2×1010pfu/ml;蛋白质印迹显示感染细胞的上清中有鼠IFN-λ2蛋白的表达,倒置显微镜显示感染的鼠肺腺癌细胞生长受到抑制。结论:成功构建了鼠IFN-λ2重组腺病毒载体,并能介导鼠IFN-λ2蛋白的表达进而抑制鼠肺腺癌细胞的生长,为进一步开展抗肿瘤研究及基因治疗奠定基础。     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

携带人白细胞介素18基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建、鉴定和滴度测定

目的构建人白细胞介素18（IL-18）基因复制缺陷型腺病毒表达载体。方法以质粒pJWIL—18为模板，设计并合成上、下游引物，利用多聚酶链反应（PCR）扩增获得IL-18基因片段，酶切后克隆至pCA13质粒，构建重组质粒pCA13IL—18。鉴定正确后，将pCA13 IL—18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9-12天出现病毒空斑。提取重组腺病毒的DNA。进行PCR鉴定。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果酶切分析、序列测定、PCR验证表明，IL-18基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体中。结论成功构建了表达人IL-18基因的复制缺陷性腺病毒载体。     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

大鼠Hes1腺病毒表达载体构建及功能鉴定

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒过表达载体(Ad-Hes1).方法 以大鼠cDNA文库为模板,PCR法扩增Hes1,通过定向克隆构建pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒,再以pShuttle-CMV-Hes1为基础,构建pAdeno-Hes1病毒质粒,将pAdeno-Hes1转染293细胞,包装Ad-Hes1,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒、pAdeno-Hes1病毒质粒构建成功,总滴度为1.6×1011 PFU,Ad-Hes1可在H9c2心肌细胞内正常表达,其MOI值为30.结论 Ad-Hes1包装成功,为进一步研究Hes1的心肌保护作用奠定实验基础.     

蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增。通过PacI酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装。包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达。结果经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺...     

大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA).方法 设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列,通过定向克隆构建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒,将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共转染293T细胞,以包装Ad-Hes1-shRNA,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定.Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达.结果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA构建成功,Ad-Hes1-shRNA包装顺利,滴度为1.0×1011 PFU/mL,并可在H9c2心肌细胞内发挥干扰效应.结论 Ad-Hes1-shRNA包装成功,在心肌细胞中具有Hes1的干扰效应.     

N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的：构建携带N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体2B亚基（NR2B）基因的腺病毒5型（Ad5）穿梭载体，为NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的包装做准备。方法：以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3．1-NR2B获得目的基因NR2B；将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515，并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞，并以RT-PCR及Western blot分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。结果：经酶切和DNA测序证实目的基因NR2B被成功克隆入载体pDC515-NR2B中，RT-PCR及Western blot检测NR2B可在293细胞表达。结论：成功构建NR2B重组Ad5穿梭载体pDC515-NR2B，该载体可用于NR2B重组Ad5载体镇痛疫苗的包装。