大鼠胚胎后肾间充质干细胞体外诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠胚胎后肾间充质干细胞(MMSCs)体外诱导分化的生物学特性.方法 原代分离培养后肾间充质干细胞,在体外特定诱导条件下观察细胞向成骨细胞、脂肪细胞及肾小管上皮细胞的分化及其形态演变,采用细胞免疫荧光检测细胞表面特定蛋白的表达变化.结果 大鼠后肾间充质干细胞在特定诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞及上皮细胞分化,免疫荧光结果显示分化后的上皮细胞E-cadherin蛋白表达明显增强,而vimentin、fibronectin的表达则明显降低甚至无表达.结论 大鼠胚胎后肾间充质干细胞在特定条件下有定向分化的能力,具有潜在分化为肾实质细胞的能力.     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

体外诱导猪骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化的实验研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向膀胱尿路上皮细胞分化的可行性研究,为组织工程膀胱的建立提供一种新的种子细胞来源.方法抽取猪的骨髓液在体外行全血原代培养、扩增及鉴定骨髓间充质干细胞.用机械分离法获取膀胱尿路上皮组织,对其行原代培养、扩增、鉴定并提取尿路上皮细胞培养液.选取第三、四代的BMSCs和尿路上皮细胞分成四组：A组：BMSCs＋尿路上皮细胞＋表皮细胞生长因子;B组：BMSCs＋尿路上皮细胞条件培养液＋表皮细胞生长因子;C组：BMSCs＋表皮细胞生长因子;D组：BMSCs 2 mL.结果用流式细胞仪检测BMSC表面特异阳性标志物CD29、CD44,阴性标志物CD45,结果均为阳性.用角蛋白AE1/AE3单克隆抗体鉴定尿路上皮细胞及实验A、B组结果均为阳性,C、D组均为阴性.结论骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力,模拟体内的微环境可使BMSC向尿路上皮细胞分化.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察

目的:研究成人脂肪间充质干细胞(hAD-MSC)体外诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器细胞和血管内皮细胞的情况.方法:分离、培养和鉴定hAD-MSC,用血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导hAD-MSC向血管内皮细胞分化,并检测血管内皮细胞标志物血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)的表达情况.制备hAD-MSC体外诱导液,用诱导剂和诱导液共同诱导hAD-MSC向视网膜细胞分化,采用免疫荧光法检测hAD-MSC经诱导后表达光感受器细胞标志物视紫红质(Rhodopsin)和RPE细胞标志细胞角蛋白(Pan-CK)的表达情况.结果:免疫荧光法证实,分离培养的hAD-MSC经体外诱导后可表达RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞的标志Pan-CK、Rhodopsin和vWF.结论:hAD-MSC经过体外诱导可以向视网膜RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞分化.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的 观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞，利用Percoll法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞，应用肝细胞生长因子(HGF)20mg／ml表皮生长因子(EGF)1．5μg／ml联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的mRNA的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形，两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达，RT-PCR检测有白蛋白的mRNA的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

胚胎肾分支形态发生调控因素

胚胎肾发育最初阶段是中肾导管尾端在胶质细胞源性神经营养因子诱导下向背侧长出输尿管芽,而后成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、骨形成蛋白、基质金属蛋白酶、整合素和粘附分子相继表达,作用于输尿管芽和间充质细胞,诱导分支形态发生,包括输尿管芽向间充质侵入、延伸以及间充质细胞向上皮转化.上述这些分子在功能上存在部分重叠与拮抗,维持细胞增殖和分化的平衡,从而保证输尿管芽形成正常的分支结构.本文对肾脏发育时期分支形态发生的调控因素进行综述.     

视黄醇对人脐带间充质干细胞表皮生长因子、干细胞因子、集落刺激因子1和白血病抑制因子的影响

目的 研究视黄醇(维生素A)对人脐带间充质干细胞表达表皮生长因子(EGF)、干细胞因子(SCF)、集落刺激因子l(CSF1)和白血病抑制因子(LIF)的影响.方法 分离鉴定人脐带间充质干细胞,待细胞生长稳定后分为4组,分别用含12％FBS、12％ FBS+1 μmol/L视黄醇、15％血清替代品(KSR)和15％ KSR+1 μmol/L视黄醇的DMEM/F12培养液培养,3d后收集细胞及培养液上清,用RT-PCR和ELISA分析视黄醇对人脐带间充质干细胞生成细胞因子EGF、SCF、CSF1和LIF的影响.结果 分离所得细胞具备人脐带间充质干细胞免疫表型特征,细胞因子EGF、SCF和CSF1在mRNA和蛋白质水平均表达,而LIF只在mRNA水平表达;添加视黄醇(1μmol/L)后,SCF和CSF1在mRNA、蛋白质水平均显著增加(P＜0.05),而EGF和LIF变化不显著(P≥0.05).结论 视黄醇(l mol/L)可促进体外培养的人脐带间充质干细胞生成细胞因子SCF和CSF1.     

成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察

目的:探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞(ADMSCs)体外分离、培养方法,并化学诱导使其向心肌细胞分化,为心肌再生医学提供理想的种子细胞来源. 方法:体外分离成人ADMSCs并进行传代培养,5-氮胞苷(5-aza)诱导其向心肌细胞分化. 分别于诱导后14,21,28 d时用免疫细胞化学染色、RT-PCR法进行心肌细胞鉴定. 结果:ADMSCs经5-aza诱导后14 d时细胞形态趋向于心肌细胞,诱导28 d免疫细胞化学显示心肌特异性肌钙蛋白I(cTN-I)、结蛋白(Desmin)表达阳性,RT-PCR检测心肌β-肌球蛋白重链(Cardiac β-MHC)基因表达阳性. 结论:成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增,体外5-aza诱导可使其向心肌细胞分化,可做为心肌再生医学的理想种子细胞.     

SD大鼠胚胎后肾间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的 对SD大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMSCs)进行分离培养,并检测其生物学特性.方法 采用胚胎后肾微组织块接种培养法,检测其生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力的鉴定.结果 MMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力.细胞周期显示90%以上细胞处于G0/G1期.表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin),几乎不表达CD34.在体外能够向成骨细胞分化.结论 原代分离、培养的细胞为MMSCs,细胞纯度高、扩增迅速、生物学性状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞.     

肝细胞生长因子对c-Kit+lin-细胞的增殖作用

目的 探讨在无血清无基质的条件下,肝细胞生长因子(HGF)和因子组合对扩增c-kit Lin-细胞的影响.方法 采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit Lin-细胞,研究在干细胞因子(SCF),FLt-3配基(FL),促血小板生成素(TPO)和白血病抑制因子(LIF)组合中添加不同浓度的HGF培养7 d,检测细胞总数,c-kit Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率.结果 各因子组均可显著扩增c-kit Lin-细胞,扩增倍数2～8倍不等.其中,10ng/ml HGF组扩增c-kit Lin-细胞效果最为显著.为8.00倍,细胞总数扩增45.43倍,细胞凋亡率为17.42%.但随剂量加大,虽然细胞总数上升,c-kit Lin-细胞扩增反而下降.40 ng/ml组细胞总数扩增80.50倍,c-kit Lin-细胞扩增效果不明显,仅为2.87倍,细胞凋亡率最低.为5.91%.结论 10 ng/ml的HGF能协同SCF FL TPO LIF扩增c-kit Lin-细胞,使细胞凋亡率降低,其表型并不受影响,但过高剂量会诱导其分化.     

建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系

目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?     

人胚胎成纤维细胞的分离、培养和鉴定及人胚胎生殖细胞体外生长所需细胞因子的表达

目的：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中分离、培养及鉴定人胚胎成纤维细胞(hEFs),检测hEFs表达人胚胎生殖细胞（hEG）体外生长所需的重要细胞因子。方法：利用酶消化法从孕5～9周龄人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中分离培养hEFs,检测其生物学特性（细胞形态、细胞生长特点、细胞周期）。采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测hEFs表达成纤维细胞特异性标志（脯氨酰4-羟化酶β亚单位）和上皮细胞特异性标志（细胞角蛋白4）的情况,对该细胞进行鉴定。应用RT-PCR检测hEG生长所需的重要细胞因子的表达,即碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和白血病抑制因子（LIF）。结果：从人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜中成功地分离培养出hEFs,该细胞可传25代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变;hEFs表达脯氨酰4-羟化酶β亚单位,不表达细胞角蛋白4,确定其为成纤维细胞;该成纤维细胞表达bFGF和LIF。结论：成功地分离和培养了人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维细胞,证明其表达对于hEG体外生长起重要作用的细胞因子。     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

胚胎后肾间充质干细胞的分离和生物学特性研究

目的探讨建立一种简便有效的体外分离纯化大鼠胚胎后肾问充质干细胞（MMSCs）的方法,并研究MMSCs的生物学特性。方法孕14天清洁级SD大鼠,脱颈处死后取其胚胎,分离胚胎肾,剪碎后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养;于倒置显微镜下观察培养细胞形态变化,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定MMSCs的生长曲线,经流式细胞仪检测CD45、CD90及CD133的表达。结果培养细胞呈现梭形或类纤维样,贴壁生长,增殖对数期始于接种后2～3人,5～6天后增殖能力减慢,渐进入平台期。CD45、CD90和CD133表达率分别为1．94％、95．43％和95．31％。结论培养细胞为胚胎后肾问充质十细胞,符合间充质干细胞特性。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞

目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34 细胞与间充质干细胞。方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34 造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率。结果:rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率为5.3%±1.7%。经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%。结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34 细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34 细胞的转染效率。