腓骨肌萎缩症SIMPLE基因突变分析

目的 探讨脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α(lipolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor,LITAF/SIMPLE)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变特点.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA直接测序和限制性内切酶酶切技术,对已经排除PMP22的大片段重复突变和PMP22、MPZ、Cx32、NEFL、GDAP1、Hsp22、Hsp27点突变的 6个常染色体显性遗传的腓骨肌萎缩症家系先证者和27个散发病例共33例患者进行SIMPLE基因突变分析,对100例健康对照者进行PCR、限制性内切酶酶切. 结果 1例散发患者检测出一个新的SIMPLE基因单核苷酸改变(G269A),位于3号外显子的G→A,导致所编码的氨基酸由精氨酸变为组氨酸(A90H),7例健康对照者等位基因同样具有此改变,说明为一种多态;另1例患者发现A274G,国外学者已证实为人群中常见的多态.结论 SIMPLE基因突变可能在我国腓骨肌萎缩症患者中少见;SIMPLE基因G269A为新发现的多态.     

dHMN-V型家系BSCL2基因和GARS基因突变分析

目的 报告1个远端型遗传性运动神经病V型(distal hereditary motor neuronopathy V, dHMN-V) 家系, 并探讨与BSCL2 (berardinelli-seip congenital lipody- strophy 2)基因和GARS基因 (glycyl tRNA synthetase)突变的关系.方法 对该家系进行临床及电生理检查,并应用PCR 直接测序法对先证者及其部分家系成员进行GARS基因全部17个外显子和BSCL2基因3号外显子突变检测.结果 该家系5代共13例患者,临床主要表现为成年起病,开始为单或双手大鱼际肌萎缩,逐渐出现小鱼际肌、手部骨间肌萎缩,遇冷挛缩,继而出现足趾骨间肌萎缩;肌电图提示运动神经神经传导速度降低,而感觉神经神经传导速度基本正常;突变分析结果显示该家系BSCL2基因3号外显子糖基化位点无突变,在GARS基因也未发现致病突变,仅在内含子区和外显子非编码区发现3个多态,分别为IVS18+136G→A, IVS17-6C→T和 C.-39G>C,其中IVS18+136G→A, IVS17-6C→T为新发现的2个多态.结论 dHMN-V具有临床和遗传异质性,其可能存在除BSCL2基因和GARS基因外的新的基因位点.     

我国特有三个小型猪品系PPARα基因的多态性分析

目的分析我国特有三个小型猪品系巴马小型猪、五指山小型猪,中国农大小型猪过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）基因exon5-intron5这段序列的单核苷酸多态性（SNPs）分布特点,为我国小型猪在糖尿病和代谢性疾病的研究中提供基础资料。方法提取三个品系小型猪血液基因组DNA,以基因组DNA为模板,应用多聚合酶链式反应（PCR）技术在合成的特异性引物引导下扩增,将PCR产物纯化,然后进行测序,再将测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析。结果测序结果显示：在PPARα基因exon 5-intron 5中存在12个单核苷酸位点,分别为83G→A,133C→T,134G→T,141C→G,146T→G,150T→G,179C→A,196C→T,205C→T,212C→T,218T→C,219T→C,其中只有83G→A这一单核苷酸突变位点位于编码区内,密码子TCA→TCG,氨基酸为Ser163Ser。结论在三个品系小型猪中PPARα基因多态位点的分布存在差异,表明小型猪的品种不同多态情况不同。     

一个遗传性非综合征型耳聋家系的 GJB2基因突变分析

目的：对1个遗传性非综合征型耳聋家系的临床表型特征进行分析,并选取 GJB2基因进行突变检测。方法详细询问病史和临床检查后,提取患者及家系成员的外周血基因组 DNA ,PCR 扩增 GJB2基因的外显子及外显子和内含子的交界区域,然后对扩增产物进行 DNA 测序和 BLAST 比对进行突变分析。结果该家系所有患者为迟发性、渐进性、早期以高频听力下降为主的感觉神经性聋。 GJB2基因突变分析检测到6种单核苷酸多态,其中 c ．79G ＞ A （p ．Val27Ile）和 c ．341G ＞ A （p ． Glu114Gly）为已知单核苷酸多态,而位于3′‐UTR 的 g ．4159T ＞ C 、g ．5142G／T 、g ．5227G／A 、g ．5352T ／C 突变为本研究新发现。结论该家系未发现 GJB2外显子致病性突变,遗传性非综合征型耳聋存在明显的遗传异质性。     

变性高效液相色谱法在FALS突变位点检测中的应用

目的检测一个肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)家系的铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn su-peroxide dismutase,SOD1)基因的突变位点,同时观察变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)的实用价值.方法对PCR-SSCP检测阴性的外显子,应用DHPLC法及DNA直接测序技术,再次进行SOD1基因的突变位点检测.结果经DHPLC检测,家系成员Ⅲ1SOD1基因的第4外显子有突变峰,DNA直接测序证实存在杂合子,发生了GAA→GGA错义突变,使编码的氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸.结论DHPLC技术与PCR-SSCP相比有更高的敏感性,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷可靠手段.     

缝隙连接蛋白B1基因新突变导致X连锁腓骨肌萎缩症的临床和病理特点

目的 报道2个缝隙连接蛋白B1(GJB1)基因新突变导致的X连锁腓骨肌萎缩症(CMT1X)家系的临床、电生理以及病理特点.方法 对两个家系的先证者行神经电图和腓肠神经活检,对先证者及家系中部分成员和100名健康人行GJB1基因测序.结果 2个家系先证者的周围神经传导速度中度减慢,腓肠神经活检可见有髓神经纤维中度减少、薄髓纤维、轴索变性及再生簇等病理改变,免疫组化染色在神经内衣及神经束衣可见CD68阳性细胞.在先证者和家系患者中分别检测到GJB1基因c.379A>T(I127F)和c.533A>G(D178G)突变,家系正常人和100名健康对照无此突变.结论 GJB1基因的I127F和D178G突变导致典型的CMT1X,临床表现具有异质性,免疫因素可能参与了致病过程.     

男性孤独症儿童甲基CpG结合蛋白-2基因突变的分析

目的:应用甲基CpG结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)基因突变筛查方法,检测孤独症患者的MECP2基因,探讨孤独症与MECP2基因的关系。方法:收集男性孤独症44例,均满足孤独症《美国精神障碍诊断和统计手册》第4版诊断标准,应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)筛查MECP2基因变异,并进行DNA测序鉴定。对存在MECP2基因错义突变的病例进行家系调查。结果:在44例患者中经DHPLC筛查阳性和DNA测序发现,4例患者存在不同的MECP2基因突变,包括c.590C>T(T197M)和c.602C>T(A201V)2种错义突变,以及c.1053C>G、c.897C>T 2种同义突变;17例的内含子3位于Exon 4前74位点C>T,为SNP(rs2071569);1例c.602C>T错义突变患者家系调查发现,突变来源于母亲及外祖父,母亲呈杂合子,为X染色体随机失活,母亲与外祖父智力均正常,外祖父有抑郁症。结论:在男性孤独症患者中,存在MECP2基因较高的变异率,MECP2基因在孤独症致病中可能起着一定作用,不除外是孤独症的易感基因。     

pEGFPN1-wtHSP22和pEGFPN1-mtHSP22载体的构建及其在人神经母细胞瘤细胞中的表达

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）是人类最常见的具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病。唐北沙等．成功定位了一个CMT2型大家系并将之命名为CMT2L，研究发现了小分子热休克蛋白22基因（HSP22）突变（423G→T，K141N）为CMT2L的致病突变。为研究HSP22的细胞内定位和生物学功能，我们运用体外基因重组技术构建pEGFPN1-^wtHSP22、pEGFPN1-^mtHSP22载体，转染SHSY5Y细胞后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的细胞内定位和聚集物形成情况。     

乳腺癌患者BRCA1基因外显子11突变研究

目的:检测乳腺癌患者(breast and ovarian cancer susceptibility gene 1,BRCA1)基因exon11突变情况及突变位置,探讨BRCA1突变与乳腺癌的关系.方法:采取105例乳腺癌标本为实验组,30例非癌乳腺组织为对照组.应用PCR-SSCP技术和DNA直接测序法检测所有标本BRCA1基因外显子11全部序列的突变情况.结果:30例非癌乳腺组织BRCA1基因外显子11未检出突变,105例乳腺癌中有10例发生基因突变,占总例数的9.5%.10例中2例为同义突变:2430T→C,2630T→G;8例为错义突变:2532T→G,2685T→C(2例),3191C→G,3232A→G,3667A→G(2例),3876C→A .结论:BRCA1基因外显子11突变与乳腺癌的发生关系密切,对其进行检测可能对乳腺癌的患病风险评估及早期诊断具有重要意义.     

大前庭导水管耳聋4个家庭的临床特征及遗传病因学研究

目的：分析大前庭导水管耳聋家庭的听力学特征及遗传病因。方法：对4个大前庭导水管耳聋家庭进行详尽的临床表型分析,并对4个先证者以家庭为单位采用两步法检测模式（4个常见耳聋基因的15项突变位点检测+已知耳聋基因的高通量测序技术）进行耳聋基因检测,对责任耳聋基因的变异位点进行直接测序验证。结果：4个耳聋家庭的6例耳聋患者表现为不同程度的感音神经性聋。4个家庭先证者均为SLC26A4突变致聋,家庭1,2同为c.919-2A＞G/c.1520delT,家庭3为c.919-2A＞G/c.754T＞C,家庭4为c.919-2A＞G/c.919-2A＞G合并MT-RNR1 m.1555A＞G致聋。结论：4个大前庭导水管耳聋家庭分别由SLC26A4基因不同突变位点所导致,与传统的直接测序方法比较,以家庭为单位的两步法检测模式更为精准高效。     

冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究

目的: 研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶(MS)基因突变的情况.方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)以及DNA测序技术,检测60例患者MS基因中与结构和功能密切相关的10个外显子的点突变情况.结果:除已知的31外显子区3个SNP位点比较常见外,还发现了1个新的点突变,3 869位为A/G杂合子(A→G的错义突变可使1 195位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸),此患者的血浆同型半胱氨酸血水平明显高于正常,为30.93 μmol·L-1.此外发现32内含子1个新的G/T多态性.结论:MS某种基因突变可能是影响MS酶功能及高同型半胱氨酸血症的原因之一.     

应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性.方法 标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血.提取所有受试者全血DNA.PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况.结果 DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243 G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点.2个新发现的SNP位点,对照组发现一种异常峰型(三峰).结论 DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生.

Abstract：

Objective To identify antithrombin Ⅲ(AT- Ⅲ) gene mutation and polymorphisms in pregnant women and parturients with cerebral venous thrombosis (CVT) using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Methods The genomic DNA was extracted from the blood samples of 50 pregnant women and parturients with CVT and 52 matched healthy women for molecular analysis using a PCR/DHPLC assay followed by DNA sequence analysis. Ten primer pairs were designed for amplifying the AT-Ⅲ promoter region and exons 1-6 including the exon/intron boundaries. A rapid screening assay based on DHPLC was established to screen the mutation and polymorphisms of AT- Ⅲ gene. Results Six abnormal peaks were detected in 40 of the patients by DHPLC. Direct DNA sequencing was performed on representative samples detected by DHPLC profiling. One pathogenic heterozygous G13328A missense mutation in exon 6, and a novel silent mutation in exon 4+243 G>A were identified. Six single nucleotide polymorphism (SNP) sites were found, including 4 previously reported ones in the SNP library and two were novel SNP sites. An abnormal peak was detected in the control group by DHPLC. Conclusion DHPLC allows automated and rapid high-throughput detection of AT-Ⅲ gene mutation and polymorphisms in the clinical setting and prenatal diagnosis. Our findings suggested that AT-Ⅲ gene mutation, as well as its polymorphisms, contributes to the occurrence of CVT in pregnant women and parturients.     

中国彝族人群CCR5基因单核苷酸多态性及其与HIV感染的关联研究

目的对中国彝族人群CCR5基因调节区和结构区的单核苷酸多态性（SNP）进行全面检测,并分析SNP与HIV感染的关联.方法通过巢式-PCR分别扩增102份彝族正常人和68份HIV感染者样本的CCR5基因调节区和结构区,利用变性高压液相色谱法（DHPLC）筛选存在突变的基因片段,对突变片段进行双向DNA序列测定,然后应用Sequence Navigator 软件对CCR5基因的单核苷酸多态性进行分析,并通过SPSS and PPAP 软件分析SNPs与HIV感染的相关性.结果在中国彝族人群CCR5基因的编码区中检测到A77G、G316A、T532C、C921T、G668A五种SNP以及第686-688位的AGA缺失突变（686Del3）,除C921T（Y307Y）为无意义突变外,其他A77G、G316A、T532C、G668A均为有意义突变,它们的氨基酸突变分别为K26R、G106R、C178R、R223Q突变.在这些突变位点中,只有G668A突变的等位基因频率较高,可达0.08, 其余均小于0.01,并且在正常人群和HIV感染者两个群体中的等位基因频率没有显著性差异（P＞0.05）;与编码区所不同的是,在调节区检测到T58934G、G59029A、T59353C、G59402A和C59653T五种SNP,他们的等位基因频率较高,在0.1912-0.2941范围之间. 所检测到的每一个突变在正常人群和HIV感染人群中的分布均差异无统计学意义（P＞0.05）.突变位点间的连锁与HIV感染的相关性,提示T59353C-G59402A单体型与HIV感染可能存在关联.结论 DHPLC是一种快速的高效筛选未知基因突变的高通量方法.SNP与HIV感染的关联性有待于进一步深入研究.     

婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症9例临床和基因突变分析

目的分析婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症(PHHI)的临床表现、遗传学特点和基因突变特点。从基因水平了解PHHI的致病因素,以达到基因诊断和遗传咨询的目的。方法对9例PHHI患儿临床表现及检查结果进行分析。提取患儿外周血基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)先扩增外周血ABCC8和KCNJ11基因外显子所在片段,对扩增片段进行正向序列测定,以检测突变。结果 2例患儿KCNJ11基因突变,1例患儿KCNJ11外显子第101位点G→A纯合突变(R34H),1例患儿KCNJ11外显子第91位点C→T杂合突变(R31W);2例患儿ABCC8基因突变,1例患儿ABCC8外显子31第3832位点出现G→A杂合突变(G1255S),1例患儿AB-CC8外显子12第1861位点出现C→T杂合突变(R598X)。结论发现4例患儿的基因突变,并发现一个国内外尚未见报道的ABCC8新突变(G1255S),为临床治疗、遗传咨询及产前诊断提供依据。     

GJB2基因在湖南地区非综合征耳聋患者中的突变分析

目的：为明确湖南地区人群中非综合征性耳聋(NSHL)患者发病的遗传学基础,分析患者间隙连接蛋白2(GJB2)基因突变的情况,并探索其发病的分子机制。方法：经过详细的病史询问和临床检查,收集符合要求、无亲缘关系的NSHL患者140例。PCR扩增患者GJB2基因的编码序列全长,纯化回收扩增产物,直接双向测序,用DNAStar软件分析测序结果,统计患者GJB2基因突变情况。设计1对错配引物并酶切以证实该新发现的突变。结果：在140名无亲缘关系的NSHL患者中,共有56例检测到GJB2基因突变,检出率达40%（56/140）;其中29例患者发现2个GJB2等位基因突变,另27例患者只有1个GJB2等位基因突变,等位基因突变率为30.4%（85/280）。总共发现10种不同的碱基变异,包括7种致病突变和3种多态。7种致病突变分别是无义突变c.139G>T,移码突变c.176_191del16和c.235delC,错义突变c.109G>A,c.344T>G,c.550C>T和c.571T>C。c.344T>G是1个新报道的错义突变。最常见的突变是c.235delC, 共有27名患者检测到该突变,达19.3%（27/140）。c.109G>A突变频率仅次于c.235delC, 有25名患者检测到该突变,检出率达17.9%（25/140）。结论：GJB2突变是导致湖南地区人群NSHL的最常见的基因突变,其c.235delC突变是湖南地区人群NSHL最常见的突变类型,发现1个GJB2基因的世界首次报道的新突变c.344T>G（F115C）。     

肝脂酶与糖尿病及动脉粥样硬化的关系

肝脂酶(HL)是脂蛋白代谢的关键酶之一,主要在肝细胞中合成,能水解各种脂蛋白中的三酰甘油和磷脂。肝脂酶基因(LIPC)变异是影响HL合成、活性改变的主要原因。LIPC启动子区有4个常见的呈连锁遗传的单核苷酸基因多态性,即-250G→A、-514C→T、-710T→C和-763A→G。LIPC的单核苷酸基因多态性与糖尿病、动脉粥样硬化等多种疾病具有相关性。     

家族性阿尔茨海默病早老素-1基因突变位点的检测

目的：探讨早老素－1基因突变在家族性阿尔茨海默病（FAD）发病中的作用。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）、变性高效液相（DHPLC）及DNA直接测序技术检测技术,对130人的阿尔茨海默病（AD）家系和50例正常对照组的早老素－1（PS－1）基因第4、5外显子进行了检测。结果：在早老素基因的第5外显子上发现除5例AD患者外,还有4例家系内正常人（Ⅳ－30、37、41、43）PCR－SSCP出现泳动异常。DHPLC检测进一步验证以上9例均表现双峰,提示可能有突变存在。DNA序列分析表明,这9例的早老素－1基因第5外显子的136号密码子发生了GCT→GGT错义突变,使氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸（Ala136Gly);第4外显子未发现突变。家系内其他人及正常对照组的PS1基因第4、5外显子经以上检测均未发现异常。结论：PS1基因第5外显子的突变点可能为中国FAD患者早老素基因突变位点之一。     

线粒体DNA3160-3755区域基因突变与2型糖尿病的关系

目的研究线粒体DNA3160-3755区域基因在延边地区2型糖尿病（T2DM）患者中的突变情况,探讨该区域线粒体基因突变与2型糖尿病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymorphismchainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）技术和直接测序法对延边地区人群108例正常健康体检者、328例T2DM患者（其中2例合并耳聋）,进行线粒体DNA3160-3755区域基因突变筛查。结果线粒体DNA3316G-A在糖尿病组和正常对照组中的突变率分别为3．7％和3．8％。两组间差异无统计学意义（P〉0．05）;3394T→C在糖尿病组和正常对照组中的突变率分别为7．3％和1．9％,两组间差异有统计学意义（P〈0．05）;在糖尿病组及正常对照组中均未检测到线粒体DNA3243A→G、3593T→C和3714A→G突变。结论线粒体DNA3316G→A突变与延边地区T2DM的发生无关;线粒体DNA3,394T→C突变与延边地区T2DM的发生有关;线粒体DNA3423A→G,3593T→C,3714A→G突变在延边地区T2DM中的发生率为0,提示上述位点基因突变率极低。     

贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型

目的研究贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因致病突变型,检测G6PD缺乏症发生率及基因频率。方法通过硝基四氮唑蓝纸片法对2 789例土家族男性进行G6PD缺乏症定性筛查,用变性高效液相色谱技术和DNA测序对78例个体进行基因突变型鉴定。结果在2 789例纯系土家族男性中,发现2例酶活性异常。在印江县采集的78例(2例酶活性异常和76例正常)纯系土家族男性血样中,共检出G6PD c.1388G>A突变2例、c.1376G>T突变1例和c.1311C>T/IVS 11+93T>C突变2例,基因突变型分别占2.6%、1.3%和2.6%。结论在贵州土家族人群中发现c.1388G>A、c.1376G>T和c.1311C>T/IVS11+93T>C 3种突变型,是共同存在于中国人群的G6PD基因突变型,中华民族可能源于共同的祖先;贵州省印江县土家族男性G6PD缺乏症的基因频率为6.5%,可为上述地区G6PD缺乏症的防治提供依据。     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的10种新突变

目的 研究中国人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变的分子基础。方法 应用PCR／SSCP、序列分析等技术,分析中国北方地区120个经典型苯酮尿症(PKU)核心家系,对PAH基因外显子3、5、7、10、11、12进行突变基因的筛查和确定。结果 在确定的31种突变中(另文报道)有10种突变首次在中国PKU人群中发现：165T、S70del、G239D、R241fsdelG、L255S、P281L、G346R、L367fsinsC、R400S和Ivsllnt2t→c。其中4种突变G239D、R241fsdelG、R400S和Ivsllnt2t→c在国际PAH数据库末见公布(至投稿日期)。新突变显示中国人PAH基因虽以点突变为主,但存在小的碱基插入、缺失以及移码突变。新突变主要发生在外显子7中(4／10),每种突变的发生频率均很低(0．42％。1．3％)。结论 中国人PAH基因存在高度异质性和突变的多样性,外显子7是PAH基因的突变热点区域。