应用荧光原位杂交检测HBV基因在转基因小鼠染色体上的整合

目的应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,检测本研究中心制备的乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠目的基因的整合位点。方法采用荧光原位杂交技术,以正常小鼠染色体标本为对照,通过荧光标记的探针与转基因小鼠染色体标本进行杂交,对比分析同一中期分裂相的G显带和FISH结果。结果转基因小鼠染色体检测到一对明显的荧光信号,推测其在14号同源染色体上,而对照组无信号。结论外源HBV基因以单位点形式稳定地整合到转基因小鼠的染色体上。     

妊娠期携带乙型肝炎病毒的母儿细胞免疫状况的研究

目的 探讨孕妇无症状携带乙型肝炎病毒（HBV）对母儿细胞免疫功能的影响。方法 采用直接免疫荧光标记法流式细胞仪检测30例慢性HBV感染孕妇外周血及其新生儿脐血的T淋巴细胞亚群和自然杀伤（NK）细胞，并与30例健康孕妇外周血及其新生儿脐血对照。结果 研究组孕妇与对照组孕妇外周血T淋巴细胞亚群，NK细胞，白细胞分类比较无统计学差异（P＞0．05）；研究组新生儿脐血与对照组新生儿脐血T淋巴细胞亚群，NK细胞，白细胞分类比较也无统计学差异（P＞0．05）。孕妇外周血与其新生儿脐血对应的各T淋巴细胞亚群，NK细胞，白细胞分类无相关性（P＞0．05）。结论 孕妇慢性携带HBV对母儿细胞免疫功能无明显影响。     

应用荧光原位杂交技术产前诊断Down综合征

目的:应用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)技术对Down综合征进行产前诊断.方法:收集产前筛查中染色体异常的高危孕妇(孕8～10周或孕16～20周) 绒毛或羊水间期细胞或染色体标本各20例,应用21号染色体特异性DNA探针对间期和中期细胞进行FISH检测,同时通过脐血淋巴细胞和外周血淋巴细胞及流产后绒毛细胞染色体的检测分析以证实产前诊断准确性.结果:全部标本杂交成功,信号强,背景低.经FISH检测的总共40例绒毛和羊水细胞中,发现21三体综合征3例,其中羊水细胞2例,绒毛细胞1例,所有产前诊断结果与追踪检查结果一致.结论:FISH技术简便、快速、特异性强、易掌握,适用于染色体异常的快速产前诊断.     

母血中胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的研究

目的 用分离到的胎儿有核红细胞,评价应用荧光原位杂交技术筛查染色体非整倍性的临床应用价值.方法 43例(孕周17～21+4周)拟行产前诊断的孕妇外周血20ml,用双密度梯度离心和双抗体磁性活化细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)方法富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞,其中10例患者富集的细胞进行吉姆萨-瑞氏染色,10例进行抗人CD235a和CD71免疫荧光抗体染色,行细胞鉴定和计数.23例富集后的细胞用荧光染色体原位杂交(fluorescence chromosomal in situ hybridization,FISH)探针进行非整倍体分析,并与羊水培养后核型分析结果进行比较.结果 所有标本均分离出有核红细胞,并经组织学染色、免疫荧光特异抗体和FISH鉴定.23例FISH诊断中,未发现非整倍体异常;14例男性胎儿有13例发现Y荧光信号,1例未发现,女性胎儿中均发现2个X荧光信号.结论 荧光原位杂交技术可对经富集的孕妇外周血中胎儿细胞进行非整倍体诊断.     

评价荧光原位杂交技术用于临床快速产前诊断唐氏综合征的可行性

目的用羊水细胞培养技术比对荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH),评价FISH用于临床快速产前诊断唐氏综合征的可行性。方法采集124名孕妇18~24周的羊水标本,应用荧光标记21号染色体特殊位点的探针(locus-spe-cific probe,LSI)及X/Y染色体着丝粒探针(centromeric probe,CEP)对未培养的羊水间期细胞进行FISH;同步进行羊水细胞培养,通过染色体核型分析,并以核型分析为标准,对FISH技术进行评价。结果124份标本发生母血污染3例,培养失败1例,将其余120份羊水标本的FISH杂交结果与其染色体核型分析结果进行了比较。FISH分析羊水间期细胞性染色体数目正常者120例(XX 58例、XY 62例);LSI 21探针的FISH结果中21号染色体数目异常者2例,核型分析为典型的21三体,取脐血进行G显带染色体核型分析得以验证为47,XY, 21。产前诊断染色体正常者追踪至分娩,行新生儿外周血染色体检查结果皆为正常核型。结论荧光原位杂交技术可用于羊水间期细胞快速产前诊断唐氏综合征。     

妊娠期携带乙型肝炎病毒的母儿细胞免疫状况的研究

[目的]探讨孕妇无症状携带乙型肝炎病毒(HBV)对母儿细胞免疫功能的影响。[方法]采用直接免疫荧光标记法流式细胞仪检测30例慢性HBV感染孕妇外周血及其新生儿脐血的T淋巴细胞亚群和自然杀伤(NK)细胞,并与30例健康孕妇外周血及其新生儿脐血对照。[结果]研究组孕妇与对照组孕妇外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞、白细胞分类比较无统计学差异(P>0.05);研究组新生儿脐血与对照组新生儿脐血T淋巴细胞亚群、NK细胞、白细胞分类比较也无统计学差异(P>0.05)。孕妇外周血与其新生儿脐血对应的各T淋巴细胞亚群、NK细胞、白细胞分类无相关性(P>0.05)。[结论]孕妇慢性携带HBV对母儿细胞免疫功能无明显影响。     

荧光原位杂交技术在唐氏综合征筛查中的应用

目的探讨荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）在唐氏综合征筛查的应用,评价其应用的可行性。方法采集200名妊娠16～20周孕妇的羊水标本,应用荧光标记21号染色体特殊位点探针（locus-specific probe,LSP）及X/Y染色体着丝粒探针（centromeric probe,CEP）对未培养的细胞进行FISH;同步进行羊水细胞培养,通过染色体核型分析,并以核型分析为金标准,评价FISH技术准确性。结果FISH分析羊水间期细胞性染色体数量均正常（XX107例,XY93例）;200例标本中21号染色体异常者3例,经核型分析为典型的21三联体,取脐血进行G带染色体核型分析得以验证2例为47,XY,＋21;1例为47,XX,＋21。产前诊断正常者进行产后新生儿外周血染色体检查无异常。结论荧光原位杂交技术FISH是快速进行产前唐氏综合症筛查的一个简易可靠值得推广的技术。     

母血中胎儿有核红细胞的荧光原位杂交法在产前诊断中的可行性探讨

探讨荧光原位杂交法（FISH）对母血中胎儿有核红细胞（NRBC）进行无创性产前诊断的可行性。20例孕龄15-20周的孕妇外周血经不连续密度梯度离心、制片、显微镜下识别并共计数NRBC及定位，然后行Y染色体的FISH检测。结果发现10例孕男性胎儿的孕妇外周血细胞涂片中每例均有阳性杂交信号出现；阳性率为60％（24/40）。10例孕女性胎儿的孕妇外周血细胞涂片中1例出现阳性杂交信号；阴性率为95％（38/40），假阳性率仅为5％（2/40）。结果提示FISH法对于用母血中分离到的胎儿细胞进行染色体异常的无创性产前遗传学检查具有重要意义。     

用荧光原位杂交技术检测hEPO转基因山羊染色体上外源基因的整合状况

目的 采用受精卵显微注射方法获得的3头hEPO转基因山羊进行检测和整合状况分析。方法 用荧光原位杂交的方法，以正常羊及正常人染色体标本为对照，通过生物素标记的探针与转基因羊染色体标本进行杂交。结果经信号放大及DAPI染色后，3头转基因羊分别在不同染色体上各有一对明显的荧光信号，而对照组无信号。结论hEPO基因在转基因山羊染色体上的整合是单位点整合，分别整合在不同的染色体上。     

国产荧光原位杂交探针在产前染色体异常诊断中的应用研究

目的：探索国产13、18、21、X和Y染色体荧光原位杂交（FISH）探针在产前染色体疾病诊断中的应用价值。方法：收集妊娠17～32周产前检查先天缺陷高危孕妇的羊水标本85例,采用国产13／21、18／X／Y号染色体探针对间期羊水细胞进行FISH检测,同时与羊水细胞培养G显带核型分析对比。结果：所有探针杂交良好,背景暗、信号明显。核型分析的报告率为98．82％,国产FISH各探针的信号率为100％,与核型分析的一致性为100％,且假阴性率和假阳性率均为0％。从采集羊水标本至得到核型分析结果平均需（15±5）d。FISH发出报告的时间为24h内。羊水细胞培养成功的84例中,发现1例染色体结构异常,核型为46,XX,-4,-15,＋t（4;15）,＋mar,本例应用13、21、18、X和Y号染色体探针进行FISH检测未见异常。结论：国产染色体荧光原位杂交（FISH）探针具有较高的细胞遗传学的检测效率,可以与核型分析相结合用于染色体病的诊断及产前诊断。     

被动免疫对HBV携带孕妇母婴传播及乳汁中HBVM的影响

目的探讨高效价乙肝免疫球蛋白（HBIG）被动免疫对乙肝病毒（HBV）母婴传播及HBV携带孕妇初乳中HBV感染性标志物（HBVM）的影响。方法将326例HBV携带而肝功能正常的孕妇按知情自愿原则分成2组，其中实验组210例，于孕晚期注射HBIG共3次；对照组116例，孕妇不接受HBIG注射。前瞻性追踪所有孕妇的新生儿外周血HBVM情况及产妇初乳中HBVM及HBV-DNA情况。结果试验组新生儿HBV宫内感染率为10．48％（22／210），对照组新生儿HBV宫内感染率为27．59％（32／116），二者比较差异有统计学意义（P：0．0000）。HBsAg单阳性的220例孕妇中，试验组和对照组新生儿HBV宫内感染率分别为7．64％和26．32％，二者比较差异有统计学意义（P=0．0000）。HBsAg和HBeAg均阳性的106例孕妇中，试验组和对照组新生儿HBV宫内感染率分别为22．73％和32．50％，二者比较差异无统计学意义（P〉0．05）。试验组产妇初乳中HBsAg阳性率、HBeAg阳性率和HBV．DNA滴度比对照组均低，但二者分别比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论孕晚期HBIG被动免疫仅可降低HBsAg单阳孕妇HBV宫内传播率，而对HBsAg和HBeAg阳性孕妇并无明显阻断作用；HBIG被动免疫对HBV携带产妇初乳中HBVM及HBV-DNA无明显影响。     

乙型肝炎病毒子宫内传播的研究

应用Southern blot杂交试验对39例流产的死胎,检测其肝细胞中HBV-DNA的存在状态。并用免疫组织化学酶标记ABC方法检测肝细胞中的HBcAg的存在状态。结果:23例HBeAg阳性孕妇胎儿中有3例,8例HBsAg单项阳性孕妇胎儿中有1例,在胎肝细胞基因组中检出整合型HBV-DNA顺序。经片断探针杂交:4例中有3例出现HBV-C基因及Pre-s基因整合型杂交带,其中2例胎肝细胞核内有HBcAg存在。证明HBV能在子宫中从HBsAg阳性携带者孕妇传给其胎儿。     

孕妇无症状HBsAg阳性胎儿宫内感染

目的:探讨乙型肝炎病毒宫内传播的危险因素和干预措施。 方法 :对在我院分娩的无症状 HBs Ag阳性产妇抽取静脉血和其新生儿脐血 ,检测乙型肝炎病毒标志物及乙肝 DNA。对部分大三阳孕妇孕晚期注射 HBIG,观察干预效果。结果 :大三阳孕妇乙肝 DNA阳性检出率明显高于小三阳孕妇 (P <0 .0 0 1) ,其新生儿脐血 HBs Ag阳性率也明显高于小三阳孕妇 (P<0 .0 5 ) ,大三阳孕妇孕晚期注射 HBIG可降低宫内传播。 结论 :患有大三阳的母亲对胎儿威胁最大 ,应在孕前进行治疗 ,孕晚期注射 HBIG可能有利于阻断母婴间垂直传播     

TLR2在慢性乙肝孕妇胎盘中的表达及与宫内感染的关系

目的：探讨Toll样受体2（ TLR2）在慢性乙肝孕妇胎盘中的表达及与宫内感染的关系。方法选择HBsAg阳性的慢性乙肝孕妇80例,其中HBeAg阳性组40例,HBeAg阴性组40例,选择同期在我院分娩的正常孕妇20例为对照组,采用ELISA法检测孕妇外周血HBV血清标志物,采用蛋白印迹法检测TLR2分别在3组胎盘中的表达水平,荧光定量PCR法检测3组胎盘中HBV-DNA含量,同时采用ELISA法检测其分娩的新生儿外周血HBsAg,记录新生儿宫内感染率。结果 TLR2在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组孕妇胎盘中表达逐渐降低,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）,胎盘HBV感染率在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组逐渐升高,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）,新生儿HBV宫内感染率在对照组、HBeAg阴性组、HBeAg阳性组逐渐升高,组间比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论TLR2可能参与了胎盘感染HBV过程,并与HBV宫内感染有着密切的联系。     

HBV-DNA的含量与宫内感染的关联性

目的：探讨孕妇血清中HBV—DNA含量与胎儿宫内感染及造成宫内感染的相关因素．方法：用ELISA方法筛选HBsAg阳性孕妇228例,并用定量PCR技术检测HBsAg阳性孕妇血清以及脐血中HBV—DNA．新生儿根据有无HBV感染分为胎儿感染组及非感染组（对照组）,调查宫内感染的相关因素,结果：HBsAg,HBeAg、抗HBc阳性孕妇的新生儿脐血HBV—DNA捡出率21％（14／68）;HBsAg．抗HBe,抗HBc阳性者为1．7％（2／117）;HBsAg和HBeAg双阳性者为20％（3／15）;HBsAg和抗HBc阳性者为11％（2／19）;HBsAg单一抗原阳性者脐血中未捡出HBV—DNA．胎儿总感染率为9,2％（21／228）．胎儿宫内感染率随孕妇血清中HBV—DNA含量增加而升高,宫内感染的危险性越大．胎儿感染组与非感染组在多种临床相关因素中先兆早产孕妇胎儿感染者多于非感染组（P〈0．05）．结论：孕妇不同的感染状态影响宫内HBV感染率,HBeAg与HBV—DNA高滴度是胎儿宫内感染的高危因素．孕妇出现先兆早产使胎儿的感染率增加．     

HBV宫内感染危险因素的病例对照研究

目的 探索乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的危险因素,为预防HBV宫内感染提供科学依据.方法 将2013年4月至2015年5月妊娠后经筛选HBsAg阳性312例孕妇作为研究对象,观察至婴儿出生后6个月,以HBsAg和(或)HBV DNA检测阳性婴儿的母亲为宫内感染病例组,其余婴儿的母亲为对照组,采用Logistic回归分析法对HBV宫内感染危险因素进行分析.采用问卷调查法收集基本资料,时间分辨免疫荧光分析法检测HBsAg,PCR方法检测HBV DNA的水平,自动生化分析仪检测ALT、AST、三酰甘油、胆固醇等肝功能指标.结果 单因素分析结果显示HBeAg、HBV DNA、羊水污染、孕期性行为与HBV宫内感染有关(P＜0.05).多因素Logistic回归结果显示:孕妇HBeAg阳性(OR=2.76,95％CI=1.19～7.94)、孕妇HBVDNA阳性(OR=9.62,95％CI=2.58～35.33)、孕期性行为(OR=1.53,95％CI=1.07～6.40)是宫内感染的危险因素.结论 孕妇HBeAg和HBV DNA阳性、孕期性行为可能是新生儿HBV宫内感染的高危因素.     

HBeAg与乙型肝炎病毒宫内感染的关系

目的探讨乙肝病毒e抗原（HBeAg）对胎儿免疫机制的影响及引起乙肝病毒（HBV）宫内垂直传播和免疫耐受的机制。方法将50例HBsAg阳性孕妇分娩的新生儿分为HBeAg阳性组和HBeAg阴性组，对母血和脐血进行HBV血清学标志物和HBV DNA的检查，并检测脐血中白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-6（IL-6）水平，同时设立正常对照组。结果孕妇HBeAg阳性和阴性者分别为27例和23例，其新生儿脐血HBeAg阳性者分别为22例和1例，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与新生儿HBeAg阴性组（27例）和正常对照组相比，新生儿HBeAg阳性组（23例）脐血IL-2、IFN-γ水平明显降低，而IL-4、IL-6水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，新生儿HBeAg阴性组（27例）和正常对照组间四种细胞因子水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论胎儿体内的HBeAg可由母体传播而来，并可能通过Th1/Th2细胞亚群失衡引起胎儿机体对HBV的免疫耐受及宫内感染的发生。     

A randomized control trial on interruption of HBV transmission in uterus

Objective To study the interruptive effect of hepatitis B virus (HBV) specific immunolobulin (HBIG) before delivery in attempt to prevent intrauterine transmission of HBV.Methods Nine hundred and eighty HBsAg carrier pregnant women were randomly divided into HBIG group and control group. Each subject in the HBIG group received 200 IU or 400 IU of HBIG intramuscularly at 3, 2 and 1 month before delivery. The subjects in the control group did not receive any specific treatment. All newborn infants received 100 IU of HBIG intramascularty after venous blood samples were taken at birth and 2 weeks after birth, followed by 30 μg plasma-derived HB vaccine or 5 μg recombinant yeast-derived hepatitis B vaccine at 1, 2 and 7 months of age. Blood tests were performed for all the lying-in women and their neonates. Blood specimens were tested for HBsAg and HBeAg by enzyme immunoassay. All infants were followed up for 1 year.Results In the HBIG group, 491 neonates were born to 487 HBV carrier mothers; and in the control group, 496 neonates were born to 493 HBV carrier mothers. The rates of intrauterine transmission in the two groups were 14.3% and 5.7% respectively (χ2=20.280, P&lt;0.001), and the rates of chronic hepatitis B in the two groups were 2.2% and 7.3% respectively (χ2=13.696, P&lt;0.001). The high risk factors of intrauterine HBV infection included HBsAg HBeAg double positive and HBV DNA positive in the peripheral blood of pregnant women.Conclusion HBV infection in the uterus may be interrupted by injecting multiple intramuscular HBIG injections before delivery without causing any side-effects.     

HBV母婴传播致新生儿免疫失败的原因和机制

目的:了解新生儿HBV免疫失败与宫内HBV感染,外周血单个核细胞(PBMC)中HBV DNA及其与白细胞介素2(IL-2)的相互关系,探讨HBV母婴传播致新生儿免疫失败的原因和内在机制.方法:52例HbsAg阳性无症状携带孕妇及其新生儿作为实验组,8例HBV M阴性孕妇及其新生儿作为正常对照组.用巢式联合酶链反应(Nested-PCR)技术检测新生儿血清和PBMC中HBV DNA,固相放射免疫法检测血清乙型肝炎病毒抗原抗体(HBV M),采用体外细胞培养和双抗体夹心酶联合免疫法检测PBMC在植物素(PHA)和HBsAg刺激下,培养上清液中IL-2的含量.结果:HBsAg阳性母亲新生儿,PBMC中HBV DNA阳性者免疫接种失败率明显高于PBMC中HBV DNA阴性者,有显著差异性(P＜0.01).PHA或HBsAg刺激下,HBsAg阳性孕妇分娩的新生儿中,PBMC中HBV DNA阳性者PBMC培养上清液中IL-2含量明显低于PBMC中HBV DNA阴性者和正常对照组新生儿,差异均有显著性(P＜0.01).而后两者比较,差异无显著性(P＞0.05).PHA或HBsAg刺激下,免疫接种失败新生儿PBMC培养上清液中IL-2含量明显低于免疫接种成功新生儿和正常对照组新生儿,差异均有显著性(P＜0.01).而后两者比较,差异无显著性(P＞0.05).结论:宫内感染HBV并侵犯PBMC,是新生儿免疫接种失败的重要原因;HBV侵犯PBMC可使其IL-2分泌能力下降,可能是导致新生儿免疫接种失败的机制之一.     

HBV携带产妇的血清及乳汁HBV-DNA载量的差异与母乳喂养安全性的研究

目的 探讨HBV携带产妇的血清、乳汁中HBV-DNA不同裁量与实施母乳喂养安全性的关系及对母婴传播阻断效果的影响.方法 应用荧光定量聚合酶链反应和酶免疫测定(EIA)技术对91例HBsAg、HBeAg双阳性产妇血清、乳汁及婴儿24月龄血标本进行HBV-DNA定量和HBVM检测.32例婴儿采用母乳喂养,59例采用人工喂养.对两种喂养方式的婴儿做3(T3)、9(T9)、12(T12)、24(T24)个月追踪检测观察.结果 HBsAg、HBeAg双阳性产妇的血清、乳汁中HBV-DNA阳性率为100%、49.45%(P＜0.005),HBV-DNA平均含量(拷贝数/毫升的对数,(-x)±s)为(7.43±1.81)、(4.02±1.01);初乳HBV-DNA的检出率随母血HBV-DNA载量的增加而增加,两者呈正相关.母乳和人工两种方式喂养的婴儿HBV感染率为15.63%和13.56%,统计学处理X2=0.022,P＞0.05差异无显著性;母乳喂养组抗体几何平均滴度(GMT)明显高于人工喂养组;发生HBV-DNA感染的13例婴儿T24血标本HBV-DNA载量为(3.24±0.23).结论 HBsAg、HBeAg双阳性产妇血清HBV-DNA载量大于109cps/mL的婴儿是母婴传播的高危易感人群.HBV感染的婴儿HBV-DNA水平较低,病毒载量＜104cps/mL.乳汁HBV-DNA阳性率和病毒载量明显低于血清,HBV携带产妇的婴儿接受正规乙肝基因工程疫苗(Hbice)全程免疫或Hbice和HBIG(乙肝免疫球蛋白)的主、被动联合免疫后,母乳喂养不影响母婴传播阻断效果,母乳喂养有助于提高婴儿抗-HBs的GMT水平.