人心钠素的蛋白质工程研究Ⅱ.基因内重组构建心钠素衍生物基因RH-2、RH-3

以精确设计的基因内重组法,利用已有的心钠素衍生物RH—1基因和心钠素α-hANP基因的重组交换,设计并构建了两种新的心钠素衍生物RH-2和RH-3基因。衍生物RH-2相当于α-hANP的N端嵌合羧肽酶抑制剂SQ20881,衍生物RH-3相当于α—hANP的C端嵌合两个脯氨酸。基因内重组获得的重组体用三种探针以原位杂交和斑点杂交等方法进行DNA区域组合分析,再经限制性酶谱分析筛选出目的克隆。DNA序列测定确认了所构建得的RH-2和RH-3基因。     

在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素

目的 构建以融合蛋白形式在大肠杆菌中高效表达心钠素的重组质粒,稳定高效地获得基因工程产品心钠素。方法 采用PCR和亚克隆技术构建带有心钠素的融合基因并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。利用操纵子重复克隆提高表达量,以凝血酶切割融合蛋白释放心钠素小肽并通过柱层析纯化蛋白质。检定产品的各项理化指标和大鼠的体内降压,体内利尿和体外舒张血管等药理活性。结果 构建了4个高效表达和心钠素融合蛋白的质粒,分别含1-4个目的基因串联操纵子;通过温度诱导表达后,该系列表达的目的分别为菌体总蛋白的46%、54.8%、56.1%和60.1%;提取纯化包涵体形式的融合蛋白后,以凝血酶切割释放心钠素,再经纯化分离出心钠素,实验室摇瓶发酵每升培养液可获3mg以上的纯度大于96%的产品,产品具有利尿,降压和舒张血管的药理活性。结论 利用融合基因的克隆与表达成功地研制了人心钠素基因工程产品。     

人肿瘤坏死因子样蛋白全长cDNA的克隆及原核表达

目的分离、克隆编码人肿瘤坏死因子样蛋白(TNFLP)的全长cDNA,并对其功能进行初步研究。方法从本室构建的λZAP表达胎脑文库中分离到编码TNFLP的全长cDNA。应用多种软件对该基因及其编码蛋白进行分析,寻找其同源蛋白,分析其亲、疏水性及其存在的结构域和基序。以Northern印迹分析检测TNFLP的mRNA的组织分布,并用谷胱苷肽-S-转移酶(GST)原核表达系统分段表达TNFLP的N端和C端蛋白。结果TNFLP全长共2112bp,编码一208个氨基酸的蛋白。亲、疏水性分析显示,TNFLP有两个疏水区,且C端95个氨基酸与小鼠的TNF-α一致性为42%。基序分析显示,TNFLP的C端有一内质网膜定位信号-TYKRL,与TNF-α完全一致。人的TNFLP位于人的16号染色体上。Northern杂交显示,TNFLP在心、脑和胰腺中呈高表达,可见一个转录本。用GST原核表达系统,分段表达了TNFLP的N端和C端。结论初步分析了TNFLP的组织表达谱,并分段表达了其N端和C端,为进一步研究其功能提供了条件。     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1（thymosin alpha 1,Tα1）的串联体并进行纯化、鉴定。方法 将Tα1的基因拆发为4个片段进行合成,退火后经PCR获得串联体基因,测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin)融合蛋白表达载体pThioHisA中,转化大肠杆菌TOP10菌株,IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q－Sepharose Fast Flow进行纯化,Western-blot进行鉴定。结果 获得了纯化的Thioredoxin-Tα1③,分子质量约为31ku。结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法,Tα1③的成功表达为检测其生物学活性奠定了基础。     

重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞因子分泌的影响

目的 研究重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌细胞因子的影响.方法 原核表达并纯化重组HBHA,N端缺失HBHA(HBHA-ΔN)、C端缺失HBHA(HBHA-ΔC)三种蛋白,用以刺激A549细胞,并设置阴性对照,观察A549细胞分泌细胞因子的情况.结果 rHBHA蛋白可以显著提高A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ的水平,而HBHA-△N和HBHA-△C蛋白对A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ和IL-10的作用无显著影响.结论 rHBHA能够促进IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ分泌,N端和C端缺失后促进作用减弱.提示HBHA在诱导自然免疫以及抵抗结核菌感染中具有重要作用.     

酵母双杂交系统筛选IRE1相互作用的蛋白质

目的：寻找与需肌醇酶1（IRE1）相互作用的蛋白质,研究该基因的功能及其在肝细胞凋亡中的作用.方法：采用酵母双杂交方法,分别以hIRE1α（人IRE1α）N端段1-465位氨基酸及C端段468-977位氨基酸为诱饵,与人睾丸cDNA文库质粒先后转化AH109酵母菌株,经三重/四重营养缺陷培养基及X-α-GAL半乳糖苷酶试验筛选,将PCR鉴定为阳性的酵母质粒转入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.最后通过酵母回转杂交实验对获得的相互作用加以验证.结果：成功构建诱饵质粒pGBKT7-IRE1N及pGBKT7-IRE1C,并在酵母中正确表达融合蛋白,自激活检测及毒性检测均为阴性.分别筛选出8个及15个与IRE1相互作用的蛋白质;通过回转实验验证,确定了能与IRE1C端段相互作用的基因SHISA5,其编码产物为SCOTIN,是P53相关定位于内质网的凋亡诱导蛋白.结论：SCOTIN与IRE1的相互作用提示内质网应激诱导的凋亡与P53通路有关.     

人α心钠素多拷贝基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素,为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试打下基础。方法：采用ＰＣＲ,克隆及连续亚克隆,序列分析,原核温度诱导表达等方法。结果：ＰＣＲ方法扩增αｈＡＮＰ基因,克隆至原核表达载体ｐＭＳ３１ｂ,热诱导表达融合蛋白。结论：在大肠杆菌中获得了人α心钠素的高表达。     

人α心钠素多拷贝基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素,为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试要下基础,方法 采用ＰＣＲ,克隆及连续亚克隆,序列分析,原核温度诱导表达等方法。结果 ＰＣＲ方法扩增α－ｈＡＮＰ基因,克隆至原核载体ｐＭＳ３１ｂ,热诱导表达融合蛋白,结论 在大肠杆菌中获得人α心钠素的高表达。     

α人心钠素基因在大肠杆菌两种表达载体系统中的高效表达

应用ＤＮＡ重组技术，将α人心钠素基因克隆到表达性质粒ＰＬＳＤ１３和ＰＬＭＧ２中，与Ｐ１噬菌体的ｒｅｆ基因片段融合，并处于ＰＬ启动子的控制之下，通过温敏的ＣＩ８５７阻遏子基因加以调控。转化大肠杆菌后，用４２℃升温诱导，使α－ｈＡＮＰ基因以融合蛋白的形成获得高效表达，产生的融合蛋白分别约占细胞可溶性蛋白总量的３５％和４８％。经一系列纯化步骤得到的α－ｈＡＮＰ２８肽样品具有明显的舒张血管和降低血压的作用     

HIV-1 SF2株env基因C1与C3区的嵌合表达

①目的 构建HIV-1SF2株env基因C1与C3区嵌合片段的克隆并在大肠杆菌中表达。②方法 用DNAstar软件辅助设计引物，以含有HIV-1SF2株前病毒基因组的9B1R6质粒为模板，PCR法分别扩增出env基因C1和C3段；两个片段经KpnⅠ酶切、T4连接酶连接和扩增后，再将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的嵌合片段插入表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达质粒pGEX-4T-2／ClC3；重组质粒经酶切、测序鉴定后，以TSS法转入大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达融合蛋白和SDS—PAGE电泳分析表达蛋白图谱。③结果 经酶切和测序分析，插入片段大小、方向和读码框架正确，无碱基错配，表明成功构建pGEX-4T-2／ClC3克隆；重组克隆在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导，高效表达出相对分子质量为4．3万的融合蛋白。④结论 重组质粒pGEX-4T-2／C1C3的构建和表达成功，为进一步研究该表达蛋白的活性和HIV疫苗的研制奠定了基础。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究

目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗。结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达。多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应。结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础。     

凝血酶调节蛋白N端155个氨基酸残基的原核表达

目的 研究凝血酶调节蛋白(TM)N端155个氨基酸残基的原核表达。方法 通过PCR特异性扩增TM编码N端155个氨基酸残基的基因片段，将目的基因片段连接入pQE31表达载体，转化入大肠杆菌中，用IPTG诱导表达。将表达的融合蛋白鉴定及纯化。结果 N端155个氨基酸残基目的蛋白在大肠杆菌中大量表达，总量达到全菌蛋白的30％以上。表达的蛋白全部以包涵体形式存在，经Westernblot鉴定为目的蛋白，可纯化和复性。结论 凝血酶调节蛋白N端155个氨基酸残基目的蛋白可通过原核大量表达，为进一步研究其功能及制备抗体提供了条件。     

人巨细胞病毒pUL76蛋白非保守C端与蛋白聚集体形成的研究

目的：通过分别构建人巨细胞病毒( HCMV) UL76基因编码蛋白的全长以及保守N端和非保守C端的真核表达质粒,探讨 pUL76引起核内蛋白聚集体形成的决定序列。方法根据GenBank中HCMV AD169(FJ527563.1)株基因序列设计分别用于扩增pUL76全长以及保守N端和非保守C端的引物,将3段序列分别构建至增强型绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)中,经双酶切和测序验证重组质粒的正确构建。空载体和3种重组质粒分别瞬时转染人胚肺成纤维细胞( HELF )和人肝癌细胞( HepG-2),经逆转录( RT-PCR)和Western blot法验证各段基因的正确表达,在荧光显微镜下观察转染不同重组质粒后细胞核内蛋白聚集体形成的状态。结果 pEGFP-N1空载体和pUL76保守N端均不能引起核内蛋白聚集体的形成,而pUL76及其非保守C端均能够引起核内蛋白聚集体的形成。结论 pUL76非保守C端是其引起核内蛋白聚集体形成所必须的。     

重叠重复人心钠素基因的化学合成及其克隆

根据人心钠素的氨基酸序列,借助于计算机,设计了8个寡核苷酸片段,并在DNA自动合成仪上合成了这些片段。经5′磷酸化、退火、连接等操作,这些片段组装成由两个心钠素基因首尾以终止起始码TGATG相连的串联体。将它插入质粒pRC_(23)转化E.coli TAP_(106)后,获得pY X_(40)对重组子的酶切图谱、原位杂交及DNA序列的分析表明,插入基因的方向、读框正确。     

基于增殖诱导配体新型抗肿瘤分子的构建及初步筛选

目的构建针对APRIL的免疫抑制分子,并对其原核表达蛋白进行纯化及活性筛选.方法将可溶性增殖诱导配体(sAPRIL)cDNA进行突变并插入TEL Th表位序列,突变体用pQE-80L/DH5α原核表达系统进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析,最后检测纯化蛋白对Raji细胞增殖的影响.结果成功构建并表达了4种sAPRIL突变体:C端引入HEL Th表位的sAPRIL突变体(Ⅰ)、N端引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅱ)、C端缺失45bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅲ)、N端缺失45 bp序列并引入HELTh表位的sAPRIL突变体(Ⅳ).SDS-PAGE电泳、Western印迹分析均检测到相应的特异蛋白带.用Ni-NTA系统成功纯化表达的突变体蛋白.细胞试验表明,突变体Ⅰ、Ⅱ纯化蛋白具有明显的促细胞增殖活性,而突变体Ⅲ、Ⅳ纯化蛋白没有促细胞增殖活性.结论在4种sAPRIL突变体中初步筛选到不具有促细胞增殖活性的APRIL免疫抑制分子,为下一步确定该分子的免疫抑制功能奠定了物质基础.     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

联合应用抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有抗原加工递呈分子基因HSP70C的HTNV嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒。方法通过PCR扩增获得HSP70C基因,分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7及pShuttle-pCAGGcS0.7中,进而构建新的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7-HSP70C及pShuttle-pCAG-GcS0.7-HSP70C。进一步通过双酶切将转移载体中的目的嵌合基因再分别克隆入腺病毒载体,得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-GnS0.7-HSP70C、rAd-pCAG-GcS0.7-HSP70C,使用Pac I线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果经过酶切、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确。免疫荧光实验检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达。结论成功制备了含抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒,为进一步研究构建的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础。     

ATRA诱导上调基因RIG-C的cDNA克隆和序列分析及蛋白表达

目的克隆和表达维甲酸诱导上调的新基因RIG-C.方法运用Blast、pfam等生物信息学手段对RIG-C的全长cDNA序列进行结构与功能预测;将RIG-C全长阅读框架插入原核表达载体pET22b中,在JM109(DE3)菌株中进行诱导表达;将全长RIG-C插入真核表达的绿荧光蛋白载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞以观察RIG-C的亚细胞定位.结果 RIG-C基因cDNA全长1266 bp,编码421个氨基酸,N端具有多个WD40结构域,C端有一个SOCS家族典型结构.原核表达的RIG-C蛋白大小约45kd,NIH 3T3细胞表达的RIG-C定位于细胞浆.结论克隆和表达了新基因RIG-C,为进一步研究其生物学功能和蛋白质的空间结构奠定了基础.     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.