干细胞因子在正常及梗死心肌中的表达

目的　通过检测正常心肌组织及心肌梗死后干细胞因子 (SCF)mRNA的表达水平 ,为探讨其在心肌梗死中的作用奠定基础。方法　将成年SD大鼠随机分为正常组、结扎 6h组、结扎 1d组、结扎 3d组 (各时间点均设假结扎组以作对照 ) ,通过结扎左前降支建立心肌梗死模型 ,假结扎组只穿线不结扎。各组取心脏左室前壁同一部位 ,提取总RNA ,用RT PCR的方法 ,以GAPDH基因为内参 ,进行半定量检测正常心脏及梗死后SCFmRNA的表达水平。结果　可溶型SCF和膜型SCF在正常心肌有低水平表达。在心肌梗死后的三个不同时间点 ,结扎组心肌组织中可溶型SCF的表达分别为假结扎组的 1 6 6倍 (P <0 0 5 )、1 5 8倍和 1 30倍 (P <0 0 1) ;而膜型SCF的表达分别为假结扎组的1 80倍、1 5 3倍 (P <0 0 5 )和 1 5 7倍 (P <0 0 1)。结论　心肌梗死可以促使SCF的表达上调 ,提示其在心肌梗死后的病理过程中以及在诱导干细胞的归巢中可能发挥作用。     

P_(77)PMC癫痫大鼠胆囊收缩素基因剂量的研究

胆囊收缩素(CCK)是一种脑肠肽,它在哺乳动物中枢神经系统的含量比任何一种已知的其它调节性激素的含量都高。我们曾发现P_(77)PMC癫痫大鼠脑中CCK含量比正常大鼠低。CCK的降低可能是由于该基因缺失或重排等异常改变造成的;也可能是该基因表达调控失常造成的。为此,我们利用从国外引进的,克隆有CCK cDNA的质粒pCCK作探针,应用Sou-     

大鼠骨髓干细胞移植对慢性心力衰竭模型缺血心肌的影响

目的探讨骨髓干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,MSC)移植对慢性心力衰竭大鼠模型心肌瘢痕周边及远隔区心肌的影响。方法制作心力衰竭大鼠模型,4周后分为细胞移植组(将5×10~6MSC注射到梗死后心肌)和对照组(注射等体积磷酸缓冲液),每组7只。组织多普勒评价室壁运动。Tunel染色检测心肌细胞凋亡情况。RT-PCR及Western杂交检测Bax、Bcl2基因和蛋白表达。结果细胞移植组在心肌瘢痕区观察到血管形成。与对照组相比,治疗后21 d移植组大鼠心肌收缩及舒张期纵向峰值速度在左室前壁、后壁、前室间隔及二尖瓣水平均显著升高[左室前壁收缩峰值速率为(0.67±0.02)cm/s对(0.31±0.02)cm/s,P<0.0013;左室前壁舒张峰值速率为(1.26±0.04)cm/s对(0.4±0.01)cm/s,P<0.001];移植组大鼠心肌凋亡细胞减少[(9.2±1.1)个/mm~2对(28.5±3.6)个/mm~2,P<0.001];瘢痕远隔区细胞比对照组细胞减小[(29.5±1.6)μm~2对(78.5±3.9)/μm~2,P<0.001]。与对照组相比,移植组大鼠心脏Bax基因和蛋白表达降低,Bcl2基因和蛋白表达升高。结论MSC移植改善瘢痕边缘缺血心肌血供,增强缺血心肌功能;拮抗细胞凋亡,防止远隔区细胞肥大。     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能***☆

背景：目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌，逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略，用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。 目的：观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca(2+) ATPase，SERCA2a) 基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞，治疗心力衰竭大鼠，比较SERCA2a基因治疗，骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。 材料：选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200~250 g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad-SERCa2a，Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成；第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。 方法：实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎，制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组：基因治疗组7只，干细胞移植治疗组7只，基因修饰的干细胞移植组8只，腺病毒空载体对照组7只，分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-SERCA2a-GFP）转染第3和8代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14，21 d采用超声心动图检测大鼠心功能。采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达；采用RT-PCR 和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达，并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性。 结果：①转染率：腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%，第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较，差异无显著性意义（P > 0.05）。②大鼠心功能：治疗后14 d，与腺病毒空载体对照组相比，其余3组左室射血分数均明显升高（P < 0.01）。治疗后 21 d，与腺病毒空载体对照组相比，干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚；干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高（P < 0.01），基因治疗组两指标改善率较治疗14 d时下降。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高（P < 0.01），左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P < 0.01)。③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性，以及Ⅷ因子表达：携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白。与腺病毒空载体对照组相比，基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强。干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达。 结论：①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率，骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体，其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用。②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关。     

人α心钠素多拷贝基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 选用合适的质粒表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人α心钠素,为人α心钠素的下游纯化工作及基因工程菌的中试要下基础,方法 采用ＰＣＲ,克隆及连续亚克隆,序列分析,原核温度诱导表达等方法。结果 ＰＣＲ方法扩增α－ｈＡＮＰ基因,克隆至原核载体ｐＭＳ３１ｂ,热诱导表达融合蛋白,结论 在大肠杆菌中获得人α心钠素的高表达。     

骨髓细胞移植上调血管内皮生长因子及其受体的表达并改善缺血心脏功能

目的：通过骨髓细胞移植对心肌梗死大鼠模型血管内皮生长因子及其受体表达的影响，探讨骨髓细胞移植改善缺血心脏功能的可能机制。方法：利用左前降支冠状动脉结扎术制备大鼠心肌梗死模型，然后行异体骨髓细胞移植；分别于术后1d，3d，7d，14d和28d取材；利用免疫荧光和RT—PCR技术分析细胞移植对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flk一1)表达的影响和移植细胞的分化情况；通过免疫组化计算血管数量；应用血流动力学检测大鼠心脏功能在术后各时间点的变化。结果：VEGF和Flk-1在移植组动物的心肌梗死区残存细胞、梗死周边区细胞以及部分移植细胞内表达。移植组VEGF和Flk-1的mRNA表达明显高于对照组。分别于术后3d和14d达到高峰，以后逐渐减弱。术后7d，14d和28d移植组血管数量较同期对照组明显增加，移植组心脏功能较对照组明显改善。术后14d可在部分移植细胞中检测到心肌细胞或血管内皮细胞特异性蛋白的表达。结论：骨髓细胞移植通过上调移植细胞及受者内源性VEGF和Flk—1的表达，促进血管新生，进而改善缺血心脏功能。     

骨髓细胞移植上调急性缺血心肌HSP32和HSP70的表达

目的 :检测骨髓细胞移植在急性心肌梗死大鼠模型中对细胞保护性蛋白HSP32和HSP70表达水平的影响 ,探讨细胞移植早期改善缺血心脏功能的可能机制。方法 :通过结扎冠状动脉左前降支制备大鼠心肌梗死模型 ,直视下心外膜注射 5× 10 6骨髓单个核细胞 ;利用免疫荧光和RT -PCR技术检测HSP32和HSP70在术后 1d、3d、7d和 14d的表达变化和移植细胞的分化情况 ;通过超声心动图分析心脏功能左室射血分数 (EF值 )和缩短分数(FS值 )。结果 :免疫荧光结果显示 ,缺血心肌中HSP32和HSP70的表达在移植组明显增强 ,并表达于部分移植细胞内。RT -PCR结果表明 ,移植组HSP32和HSP70的mRNA表达明显高于对照组 ,术后 3d达到高峰 ,比对照组分别增加 5 .0倍和 2 .9倍 (P <0 .0 1)。术后 7d ,移植组EF值和FS值明显高于同期对照组 (14 %和 2 2 % ,P <0 .0 5 ) ;术后 14d ,可在移植的骨髓细胞中检测到心肌细胞和血管内皮细胞特异性蛋白的表达 ,EF值和FS值进一步增加。结论 :骨髓细胞移植早期 ,细胞移植能够上调细胞保护性蛋白的表达 ,促进急性缺血心脏功能恢复     

氧化还原因子1促进乳鼠心肌成纤维细胞增殖

目的:研究氧化还原因子1(redox factor 1,REFI)对乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其可能的机制.方法:为证实REF1在乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用,构建重组Ref1野生型和突变型的腺病毒载体,感染乳鼠心肌成纤维细胞.通过RT-PCR和Western印迹检测Ref1以及与胶原合成相关的基因表达的改变,通过免疫荧光检测REF1核转位,利用MTT和流式细胞仪分析细胞增殖和细胞周期,用电泳迁移率实验(electrophoretie mobillty shift assay,EMSA)检测REF1对转录因子活化蛋白1(activator protein 1,AP1)的DNA结合能力的影响.利用含25 mmol/L的葡萄糖培养基模拟高糖环境,观察对乳鼠心肌成纤维细胞增殖及REF1表达与活性的影响.结果:MTT比色法显示,感染野生型Rdf1重组腺病毒的细胞在490 nm处的光密度值明显高于对照病毒组(0.671±0.044vs0.364±0.007,n=6,P<0.01).流式细胞仪对细胞周期的分析表明,野生型Rdf1能明显增加S期细胞的百分率(16.8%±0.62%vs9.04%±0.43%,n=3,P<0.05).RT-PCR检测发现,野生型Rdf1促进细胞Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,ColⅢ)mRNA表达增多,但突变型Rdf1对细胞的增殖和胶原的合成均没有明显影响.EMSA实验结果显示,感染野生型Ref1重组腺病毒的细胞AP1的DNA结合能力增强.高糖培养基培养乳鼠心肌成纤维细胞同样能增强AP1的DNA结合能力.高糖培养虽然对Rdf1的表达水平没有影响,但增强了细胞中REF1的核转位,促进了细胞的增殖.结论:REF1促进乳鼠心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成,其机制町能是通过上调AP1的DNA结合能力.     

IL-1对大鼠脑组织β淀粉样前体蛋白基因表达的影响

目的：研究在整体动物水平白细胞介素1（interleukin1，IL－1）对β淀粉样前体蛋白（βamyloidprecursorprotein，APP）基因表达的影响。方法：大鼠侧脑室注射；Northern杂交。结果：首次证实IL－1β在整体动物水平可以诱导大鼠脑组织APPmRNA表达的增加，而且这种诱导作用具有时间依赖性。结论：IL－1β在体内、外均可诱导神经组织内APP基因的表达增加，进而在阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）中与促进β淀粉样蛋白（βamyloidprotein，βAP）的沉积可能密切相关。     

阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白可与低密度脂蛋白受体相关蛋白6直接作用

目的:研究低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein6, LRP6)的胞内代谢及其与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的相关性.方法:构建含有APP羧基端106个氨基酸的融合表达质粒,用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库.结果:发现LRP6的羧基端可以和含有β淀粉样蛋白和胞内区的APP片段相互作用.结论:使与AD相关的两个重要蛋白载脂蛋白E和APP联系起来,并提示LRP6可能在APP的代谢和β淀粉样蛋白的产生中起重要作用.