hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列,克隆入载体pMD18-T,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析;利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH-5α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致,pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,并构建其真核表达载体pEGFP-NGF,为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264．7细胞克隆的建立

目的：构建携带细胞内病原体抗性基因1（1pr1）,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导人鼠巨噬细胞RAW264．7中表达．方法：KpnⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒pET32a（＋）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆人pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1-Ipr1．脂质法转染体培养的RAW264．7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ernBlot方法验证Ipr1蛋白水平的表达．结果：酶切鉴定获得一条约4700bp空载体条带及一条约1338bp目的片段,证明pEGFP-C1-Iprl真核表达载体构建成功．pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264．7细胞后,WesternBlot可以检测到约Mr77×10^3的融合蛋白在RAW264．7细胞中表达,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达．结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264．7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究Ipr1的功能奠定了基础．     

髓系细胞触发受体-1真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建髓系细胞触发受体-1(TREM-1)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从人外周血总RNA中扩增TREM-1 基因的全长cDNA,插入克隆载体pUCm-T,BamH I和Pst I,酶切后将目的片段插入真核表达载体pEGFP-C3,构建含有TREM-1的重组质粒pEGFP-TREM-1,转染293细胞,用荧光显微镜观察、Western-blot鉴定蛋白表达.将pEGFP-TREM-1重组质粒转染THP-1细胞,100 ng/ml LPS刺激24 h后,半定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1β基因的 mRNA水平.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为TREM-1基因;经转染的293细胞在荧光显微镜下可见荧光,并能表达TREM-1蛋白;重组TREM-1蛋白具有生物学活性,能增强TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平.结论:成功构建了能够表达TREM-1的真核表达质粒pEGFP-C3-TREM-1,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.     

沙眼衣原体热休克蛋白10基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的从临床标本中获得沙眼衣原体（Ct）热休克蛋白（cHSP）10基因，构建真核表达重组质粒。利用脂质体体外转染Hela细胞，为研究cHSPl0生物学功能和Ct核酸疫苗的研制做准备。方法用PCR技术从40例金标法阳性的临床标本中扩增cHSP10基因片断，重组入pMD18-T克隆载体。将pMD18-T／cHSP10外源基因片断经酶切鉴定后。克隆入pcDNA3．1（＋）中，经过序列分析和酶切鉴定后，运用脂质体将该重组体转染Hela细胞。ELISA方法观察目的基因的表达。结果PCR扩增得到cHSP基因全长。大小为306bp，序列测定与GmxBank（M58027）发布的序列一致；构建得到cHSP10基因真核表达载体；该真核表达载体在Hela细胞表达cHSP10。结论成功构建cHSP10基因真核表达载体，该重组质粒能在Hela细胞中表达cHSP10，为进一步研究cHSP10生物学功能和Ct核酸疫苗的研制提供了实验基础。     

稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em;分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm,再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3,1（-）,构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm,经酶切鉴定及测序正确后,通过脂质体转染至P815细胞,持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT—PCR,IFA,Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm,建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体,稳定转染P815细胞,为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．     

hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα -LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a（+）质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法根据trkB基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断,插入克隆载体pMD 18-T,构建pMD 18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断,再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1 461 bp,真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子,基因测序结果与已知序列基本吻合。结论成功扩增出完整trkB基因,构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白?方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T 载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因?双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达?结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功?Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达?结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础?     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的 构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法 根据trkB基因已知序列，设计合成一对引物，上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点，用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断，插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断．再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果 trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1461bp，真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功扩增出完整trkB基因，构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究

目的：构建人stathmin基困的siRNA真核表达载体,探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用．方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体,酶切及测序鉴定．脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT—PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果．结果：经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体＋经脂质体转染HeLa细胞后,RT—PCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低．结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer—S1和pSilencer—S2,并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用．     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

Hath1基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的：构建携带Hath1基因的真核表达载体并转染神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,观察其在SH-SY5Y细胞中的表达。方法： 从人全血中提取DNA,克隆Hath1基因,同时扩增色荧光蛋白（GFP）gfp基因;利用引物GFP-R和Hath1-F扩增融合基因gfp-Hath1,克隆至pMD18-T中;经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶酶切,构建重组表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1;转染SH-SY5Y细胞。结果：PCR扩增,融合基因gfp-Hath1扩增条带大小为2 023 bp,表明成功扩增gfp-Hath1融合基因。经双酶切鉴定,成功构建真核表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1。采用间接免疫荧光技术在荧光显微镜下观察到5H-SY5Y细胞中有GFP表达。结论：本研究成功地使Hath1基因在SH-SY5Y细胞中得到表达,为转染耳蜗组织的实验及探索治疗耳聋新方法奠定基础。     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.