不同浓度牛磺酸对兔角膜内皮细胞的影响

目的 探讨牛磺酸对兔眼角膜内皮细胞的毒副作用.方法 取家兔6只(共12眼),每只眼制取6片组织片,用组织块培养法培养兔角膜内皮细胞,细胞接种于12孔培养板,分别加入2%、4%、6%、8%、10%的牛磺酸液(同一动物的左右眼加同一浓度牛磺酸溶液),设立空白对照.倒置显微镜观察角膜内皮细胞的生长情况;在培养的第1、2、4、6、8天,将部分培养细胞用Wright染色后观察细胞形态.结果 空白对照和加入2%、4%、6%牛磺酸溶液培养的角膜内皮细胞,1周后均形成内皮细胞层,细胞形态呈六角形或类圆形.加入8%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第4天时生长不良,细胞胞体小;第8天时培养细胞死亡.加入10%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第2天时出现生长不良,细胞胞体小,部分细胞已死亡.同一动物的左右眼角膜内皮细胞生长速度和细胞形态相似.结论 2%～6%牛磺酸对兔角膜内皮细胞的生长无不良影响,提示该浓度范围的牛磺酸对角膜内皮细胞无毒副作用.     

牛磺酸对体外培养的兔角膜基质细胞增殖的影响

目的观察牛磺酸对兔角膜基质细胞增殖的影响。方法将体外培养的原代兔角膜基质细胞传至2～3代用于实验,分别加入25、50、100、200、400mmol／L的牛磺酸,用药后2、4、6、8天倒置显微镜下加台盼蓝染色活细胞计数,计算细胞抑制率,并于2、4、6天进行MTT方法检测。结果细胞计数和MTT法均显示牛磺酸浓度≥100mmol／L时,作用2天、4天和6天对兔角膜基质细胞增殖均有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性。结论牛磺酸具有抑制兔角膜基质细胞增殖的作用,该研究结果为防治PRK和LASEK术后角膜上皮下混浊（haze）形成提供了客观依据。     

兔眼角膜成纤维细胞原代培养

目的:建立眼角膜成纤维细胞体外培养的方法。方法:采用全角膜组织培养法培养兔角膜成纤维细胞。结果:在培养皿中培养1天后细胞开始贴壁,6天有新生细胞分出,形成梭形的成纤维细胞。传代细胞经4-6天可形成密集的成纤维细胞,细胞呈纤维状,呈漩涡形排列,排列整齐,局部细胞相互平行,第4、5代生长情况良好,细胞生长旺盛,细胞呈密集漩涡形排列。结论:眼角膜成纤维细胞全角膜组织培养法是可行的。     

水蛭素对体外培养的兔血管内皮细胞及平滑肌细胞生长的影响

目的探讨水蛭素对体外培养的兔血管内皮细胞及平滑肌细胞生长的影响及剂量依赖关系。方法用体外培养兔血管内皮细胞及平滑肌细胞第3~5代,加入96孔细胞培养板,同时加入不同浓度的水蛭素0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25 mg/L,每6孔为一个浓度组,1640培养液为空白对照组,共7组,培养48 h后用噻唑蓝比色试验(MTT法)测定各孔贴壁细胞的吸光值(OD)。结果与空白对照组相比,低、中、高浓度水蛭素作用于体外培养的兔血管内皮细胞后,细胞形态无明显改变,贴壁良好,生长无明显抑制作用(P>0.05);而水蛭素作用于兔血管平滑肌细胞后,与空白对照组相比,低浓度水蛭素对平滑肌细胞形态无明显改变,中、高浓度水蛭素作用于平滑肌细胞后,细胞密度有所减小、排列松散,OD值下降,呈现抑制平滑肌细胞的生长(P<0.05)。结论不同浓度水蛭素对体外培养兔血管内皮细胞生长无显著抑制作用;低浓度水蛭素对体外培养兔血管平滑肌细胞生长无明显抑制作用,中、高浓度水蛭素可抑制兔血管平滑肌细胞的生长。     

角膜内皮层培养及后板层移植的实验研究

目的探讨体外构建角膜内皮层并进行移植的可能性。方法体外培养的兔角膜内皮细胞种植于羊膜基底膜上,形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学及超微结构的观察。将构建的角膜内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植作为对照,术后观察角膜透明度及厚度,对内皮层进行形态学和组织学观察。结果角膜内皮细胞在羊膜上生长呈单层,细胞为多角形,排列紧密,其形态及结构与正常兔角膜内皮组织相似。培养内皮层移植后,角膜维持相对透明及薄度;而对照眼角膜严重水肿、混浊,厚度明显大于实验眼角膜(P<0.01)。培养内皮移植后具正常内皮层的结构和功能。结论羊膜是培养角膜内皮细胞移植的良好载体,培养角膜内皮移植有望治疗角膜内皮失偿疾病。     

角膜内皮层培养及后板层移植的实验研究

目的探讨体外构建角膜内皮层并进行移植的可能性.方法体外培养的兔角膜内皮细胞种植于羊膜基底膜上,形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学及超微结构的观察.将构建的角膜内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植作为对照,术后观察角膜透明度及厚度,对内皮层进行形态学和组织学观察.结果角膜内皮细胞在羊膜上生长呈单层,细胞为多角形,排列紧密,其形态及结构与正常兔角膜内皮组织相似.培养内皮层移植后,角膜维持相对透明及薄度;而对照眼角膜严重水肿、混浊,厚度明显大于实验眼角膜(P<0.01).培养内皮移植后具正常内皮层的结构和功能.结论羊膜是培养角膜内皮细胞移植的良好载体,培养角膜内皮移植有望治疗角膜内皮失偿疾病.     

兔角膜内皮细胞的原代培养

目的: 探讨兔角膜内皮细胞的培养方法。方法: 显微分离兔角膜后弹力层-内皮细胞层,采用贴壁法、贴壁消化法及两种消化法培养,观察每种方法细胞生长的特点。结果: 4种方法培养的兔角膜内皮细胞均呈单层密集生长,形态为六角形或多边形,具有活体细胞的形态特征。培养周期最短约为1周。结论: 将揭取的附有内皮细胞的后弹力层预培养1天后再进行消化培养的方法,可为实验研究提供有效的角膜内皮细胞培养方法。     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养和鉴定

目的 建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,通过形态学观察并应用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定.结果 兔角膜上皮原代培养第2天,组织边缘有细胞游出,细胞和细胞核均呈圆形,胞核位于细胞中央或旁中央区;第3天,细胞呈扁平多...     

兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的比较性研究

目的：探讨自体血清与来源于同一个体的组织培养之间的关系及比较兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的不同。方法：采用组织块培养法,分别采用兔自体血清及胎牛血清培养兔角膜缘细胞。结果：兔血清培养72h,细胞从组织边缘流出,第8天,膜布满整个孔底,第10天细胞呈空泡样,第14天,膜化解;胎牛血清培养48小时,细胞从组织边缘游出,第8天,膜布满整个孔底,第11天细胞呈空泡样,第16天,膜化解。结论：从形态学上观察,兔自体血清和胎牛血清培养的兔角膜缘细胞无明显差别,兔自体血清可用于兔角膜缘细胞的培养。     

角膜内皮炎药物治疗后内皮细胞的观察

目的探讨角膜内皮炎对角膜内皮细胞数量和形态的影响。方法选择角膜内皮炎患者20例（20眼）,其中盘状型13例,弥漫型7例。入院后常规给予抗病毒药物及皮质类固醇激素眼水。应用角膜内皮镜于治愈后4～6周观察角膜内皮细胞的密度、六边形细胞的比例及变异系数的变化,并以健眼为对照组。结果治疗组角膜内皮细胞的密度较对照组明显降低,六边形细胞所占的比例降低,而变异系数增加;弥漫型内皮炎组与盘状型内皮炎组比较,细胞密度降低,六边形细胞所占的比例降低,变异系数增加。结论角膜内皮炎对角膜内皮细胞造成损害,导致明显的内皮细胞数量和形态改变,不同分型之间存在区别。     

利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究

目的 观察皮肤干细胞在角膜基质上的分化发育情况,探讨皮肤干细胞重建角膜上皮的可能性。方法 将体外分离培养的1～4代人和兔皮肤干细胞种植在兔角膜基质上,在体外和体内观察皮肤干细胞的分化发育情况。实验标本作HE染色及用人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体和角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12抗体AE5进行免疫组织化学鉴定。结果 皮肤干细胞在角膜基质的调控下可以横向分化发育成表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12的细胞,呈现AE5抗体阳性;并可形成类似角膜上皮外观透明的多层细胞结构。结论 利用皮肤干细胞有可能重建角膜上皮,进行自体生物角膜的构建。     

虹膜固定型屈光性人工晶状体植入术对角膜内皮细胞的影响

目的 评价虹膜固定型屈光性人工晶状体植入术对患者角膜内皮细胞的影响。方法我院采用虹膜固定型屈光性人工晶状体植入术治疗高度近视患者12例（19眼）。分别于术前、术后3个月及6个月,检测所有患者角膜内皮细胞计数、计算角膜内皮丢失率以及人工晶状体与角膜的距离,并作比较分析。结果所有患眼均手术成功．术后第1天11眼角膜透明,8眼角膜上皮轻度水肿,经局部及全身糖皮质激素对症治疗后,于术后3～5d消退;术后随访6个月,所有患者角膜均透明。术后3、6个月角膜内皮计数[（2783±214）、（2749±232）个／mm^2）]均较术前[（2937±196）个／mm^2]明显减少（均P〈0．05）;而术后6个月角膜内皮计数、角膜内皮丢失率[（5．76±0.23）％]以及人工晶状体与角膜的距离[（2．69±037）mm]与术前3个月[（5．24±0．11）％、（2．73±0．18）mm]均无明显差异（均P〉0．05）。结论虹膜固定型屈光性人工晶状体植入术后,角膜内皮细胞近期存在丢失现象,但3个月后趋于稳定,中远期效果尚需进一步观察和研究。     

牛磺酸对角膜基质细胞增殖和移行的影响

目的:观察牛磺酸(taurine)对体外培养的兔角膜基质细胞增殖和移行的影响。方法:将原代培养的兔角膜基质细胞传至2代～3代用于实验,分别加入不同浓度的牛磺酸,用细胞计数法和MTT法检测牛磺酸对角膜基质细胞增殖的影响;用缺损闭合法观察牛磺酸对角膜基质细胞移行的影响。结果:细胞计数法和MTT法均显示牛磺酸浓度≥100 mmol/L时对兔角膜基质细胞增殖均有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性。缺损闭合法显示牛磺酸对角膜基质细胞移行具有抑制作用。牛磺酸浓度低于100 mmol/L时对兔角膜基质细胞抑制作用不明显。结论牛磺酸具有抑制兔角膜基质细胞增殖和移行的作用,对于防治角膜创伤修复后瘢痕形成,特别是准分子激光术后角膜上皮下雾状混浊的形成具有十分重要的意义。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

利用膜片钳技术对体外培养的兔角膜内皮细胞膜电位的研究

目的利用膜片钳技术测定体外培养的兔角膜内皮细胞（RCECs）的膜电位。方法运用接膜法联合组织块法获得原代及传代培养的RCECs,利用免疫组织化学方法对其鉴定,采用全细胞膜片钳方法,测定培养RCECs的膜电位。结果原代RCECs的平均膜电位水平为（-20.9±1.7）mV（n=6）,而传二代细胞为（-15.1±1.8）mV（n=6）。2组间差异具有统计学意义。结论利用膜片钳技术成功记录到体外培养的RCECs膜电位且原代RCECs的平均膜电位水平高于传二代RCECs。     

兔角膜上皮细胞培养后增殖能力的观察

目的:了解培养的兔角膜缘上皮细胞在原代及第2代细胞汇合时的增殖能力。方法:选健康新西兰白兔7只,显微镜下手术切取左眼上方少量角膜缘组织,采用组织块法分别进行培养,在原代上皮细胞汇合传代时(6鄄8d)和第2代细胞汇合时(10鄄12d),用流式细胞仪(FCM)检测样本的细胞周期和凋亡细胞。结果:培养的原代及第2代上皮细胞汇合时平均的增殖指数(PI)为19.1%和9.8%,凋亡细胞比例分别为0.57%和0.37%,处于增殖期细胞的比例在减少,而凋亡细胞的比例一直较低。结论:组织块法适合兔角膜缘上皮细胞培养,并且原代培养的兔角膜缘上皮细胞比第2代细胞具有更强的增殖能力,更适合进行细胞移植。