人皮肤干细胞体外诱导分化构建人工结膜的实验

 【目的】观察皮肤干细胞在结膜去细胞基质上的生长和分化情况，探讨利用皮肤干细胞及结膜去细胞基质构建人工结膜的可能性。【方法】将体外分离培养的1～2代人皮肤干细胞接种于人结膜去细胞基质上，在体外观察细胞的分化情况。标本分别行HE染色、人上皮细胞角蛋白CKl9单克隆抗体、结膜上皮细胞特异性标记蛋白CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体免疫组化鉴定。【结果】皮肤干细胞在结膜去细胞基质等模拟的体外微环境下可形成类似结膜上皮细胞的复层增生，并有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，呈CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体表达阳性。【结论】利用皮肤干细胞可在体外模拟的微环境下分化构建人工结膜，用于结膜移植眼表重建。     

人皮肤干细胞体外诱导分化构建人工结膜的实验

【目的】观察皮肤干细胞在结膜去细胞基质上的生长和分化情况，探讨利用皮肤干细胞及结膜去细胞基质构建人工结膜的可能性。【方法】将体外分离培养的1～2代人皮肤干细胞接种于人结膜去细胞基质上，在体外观察细胞的分化情况。标本分别行HE染色、人上皮细胞角蛋白CKl9单克隆抗体、结膜上皮细胞特异性标记蛋白CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体免疫组化鉴定。【结果】皮肤干细胞在结膜去细胞基质等模拟的体外微环境下可形成类似结膜上皮细胞的复层增生，并有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，呈CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体表达阳性。【结论】利用皮肤干细胞可在体外模拟的微环境下分化构建人工结膜，用于结膜移植眼表重建。     

表皮干细胞体外诱导转分化为角膜上皮细胞的实验研究

目的探讨表皮干细胞向角膜上皮细胞转分化的可塑性.方法用Ⅳ型胶原筛选的方法培养并鉴定表皮干细胞,经体外与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,免疫组化检测角膜上皮细胞特异标志物K12表达.结果获得的表皮干细胞表现出很强的增殖潜能,光镜下为原始细胞形态特征,能强表达K19和β1-integrin,共培养2周后可见细胞分化,细胞表达角膜上皮特征性K12.结论在本实验的体外诱导条件下,表皮干细胞能转分化为角膜上皮细胞.     

无血清培养的角膜缘干细胞的生物学特性

目的 分析无血清培养基对兔角膜缘干细胞培养的影响.方法 获取兔角膜缘组织,酶分离后获得单细胞悬液进行体外无血清培养,观察其细胞克隆能力,并以羊膜为载体进行有血清条件下诱导分化的观察,采用免疫细胞化学技术检测培养细胞的PCNA、AE1、AE5的表达.结果 在无血清培养条件下角膜缘细胞具有细胞克隆能力,PCNA表达阳性,AE1呈阳性,AE5呈阴性,在羊膜载体上经血清诱导,出现AE5阳性的呈多角形胞体的上皮样细胞,在羊膜上排列呈复层.结论 应用无血清培养基培养兔角膜缘干细胞能获得成功,为体外培养扩增角膜缘干细胞提供了新的选择.     

毛囊bulge细胞在角膜缘基质诱导下向角膜上皮细胞分化的初步研究

目的探讨体外培养的毛囊bulge细胞向角膜上皮细胞分化的可能性。方法体外分离培养毛囊bulge细胞,然后在transwell中与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,观察毛囊bulge细胞的分化情况,免疫组化检测K12及K19表达的变化。结果体外培养的毛囊bulge细胞保持高增殖,低分化状态。经过2周左右的共培养,毛囊bulge细胞逐渐分化,部分细胞K12表达阳性。结论角膜缘基质细胞可以诱导毛囊bulge细胞向角膜上皮细胞分化。     

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究

目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的鼠胚胎干细胞系,并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,Es细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件,为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞,对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件,定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化,观察培养后形态改变,免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。结果转染后ES细胞稳定表达GFP,成功诱导出角膜上皮样细胞,呈典型上皮样细胞形态,免疫组化及RT-PCR检测显示,K12及CD44表达阳性,K14表达阴性。结论转染GFP的ES细胞,在Ⅳ型胶原的诱导下,成功向角膜上皮细胞分化。     

角膜缘基质诱导毛囊干细胞角膜上皮样转分化的研究

目的 体外诱导培养毛囊干细胞角膜上皮样分化.方法 体外分离培养毛囊干细胞,然后用角膜缘基质组织匀浆液对其进行诱导培养,并用免疫细胞化学(ICC)法检测诱导前后α6-integfin、CD34、K12的变化;RT-PCR方法检测细胞诱导前后K12的mRNA表达情况;流式细胞分析(FCM)检测毛囊干细胞角膜上皮样分化的阳性率.结果 体外培养的毛囊干细胞保持高增殖的状态,α6-integrin、CD34干细胞质表达.经过10 d的诱导培养,可见K12于细胞质阳性表达;RT-PCR结果显示毛囊干细胞经诱导后K12的mRNA明显表达;FCM结果亦显示毛囊干细胞经诱导培养后有较高比率的K12阳性细胞.结论 毛囊干细胞经角膜缘组织匀浆液体外诱导可成功地分化为角膜上皮样细胞.     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。     

Treatment of rabbit corneal with skin epidermal stem cells

OBJECTIVE: To construct artificial rabbit corneas with autologous skin epidermal stem cells and allogenic stromal cells in vitro and promote healing of corneal wounds. METHODS: Skin epidermal stem cells were isolated from autologous skin samples. Keratocytes were isolated from newborn cornea biopsies. The cells were combined with acellular porcine corneal stroma scaffold to construct artificial corneas. Then the constructed artificial corneas were used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells. RESULTS: Cultured skin epidermal stem cells and keratocytes were in good growth conditions. Cultured artificial corneas consisted of multiplayer epithelial cells growing on stroma equivalent consisting of stromal matrix with incorporated keratocytes. The in vitro constructed artificial corneas were histologically similar to normal rabbit corneas. Three months after transplantation, the cornea wounds were healed and the rabbit cornea became transparent. CONCLUSION: The artificial corneas were constructed successfully in vitro and can be used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells.     

利用表皮干细胞治疗兔角膜缘干细胞缺损

目的利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞在体外构建双层组织工程角膜,并修复兔角膜缘干细胞的缺损.方法建立兔角膜缘干细胞缺损模型,以去细胞猪角膜基质片作为支架材料,以自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞作为种子细胞,在体外构建组织工程角膜,并用来修复兔角膜缘干细胞缺损.结果利用自体表皮干细胞与异体角膜基质细胞复合异种去角膜基质片在体外成功构建组织工程角膜;构建的组织工程角膜与正常角膜相似,具有上皮层和基质层;用组织工程角膜修复兔角膜缘干细胞缺损3个月后,损伤角膜透明度恢复良好,组织学结构基本恢复正常.结论成功构建了兔的双层组织工程眼角膜,并修复了兔角膜缘干细胞缺损.     

兔角膜内皮细胞的原代培养

目的: 探讨兔角膜内皮细胞的培养方法。方法: 显微分离兔角膜后弹力层-内皮细胞层,采用贴壁法、贴壁消化法及两种消化法培养,观察每种方法细胞生长的特点。结果: 4种方法培养的兔角膜内皮细胞均呈单层密集生长,形态为六角形或多边形,具有活体细胞的形态特征。培养周期最短约为1周。结论: 将揭取的附有内皮细胞的后弹力层预培养1天后再进行消化培养的方法,可为实验研究提供有效的角膜内皮细胞培养方法。     

重组人角质细胞生长因子-2对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用

目的: 研究外用旋滴重组人角质细胞生长因子-2（KGF-2）对兔碱烧伤模型角膜上皮损伤的治疗作用,为角膜上皮损伤的早期治疗探索新方法。 方法: 制备兔角膜碱烧伤模型,60只日本大耳白兔随机分为碱烧伤对照组和KGF-2组（25 mg/L）(n=30);各组日本大耳白兔于造模后以50 μL药物滴眼,每日3次。7和14 d裂隙灯观察角膜烧伤面积以及角膜新生血管的形成,MTT法检测角膜上皮细胞活性,免疫组化方法进行病理组织学检查。结果：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组角膜烧伤面积小于碱烧伤对照组,差异有显著性（P<0.01）。碱烧伤对照组7 d角膜新生血管发生率为17.50%,KGF-2组为7.32%;碱烧伤对照组14 d角膜新生血管发生率为41.67%,KGF-2组为32.5０%。MTT检测结果显示：碱烧伤后7和14 d,KGF-2组492 nm吸光度与碱烧伤对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。碱烧伤后7和14 d,病理切片HE染色显示：对照组角膜基质水肿,板层纤维排列松散、紊乱,炎症反应反复出现,角膜上皮层变薄,部分脱落,角膜内皮层内侧有大量成纤维细胞增生;KGF-2组碱烧伤后7 d,角膜上皮细胞生长良好,基质轻度增厚,无明显的炎症反应;碱烧伤后14 d,未出现炎症复发,角膜上皮细胞生长良好,排列整齐,角膜基质仅有轻度增厚。结论：外用旋滴25 mg/LKGF-2可加速角膜上皮损伤的恢复,减轻角膜烧伤的各种炎症反应症状;减轻角膜基质水肿和纤维化,同时KGF-2 亦表现出显著的抑制角膜新生血管形成的作用;KGF-2有可能成为另一个对角膜上皮损伤具有重要调控作用的生长因子。     

兔角膜上皮——基质层组织工程方法三维重建

目的：利用细胞生物学和工程学原理在体外重建角膜上皮和基质层,提供与正常生理结构相似的模型。方法：兔角膜上皮和基质细胞原代并传代培养,免疫组化方法对细胞进行鉴定,以鼠尾为原料提取I型胶原溶液,重建角膜的基质和上皮,上皮实行气-液界面培养,倒置显微镜观察细胞形态。36h、72h、7d、14d、20d重建组织常规病理切片。结果：倒置显微镜下角膜成纤维细胞呈梭形三维生长,上皮细胞多层生长。组织病理检查显示重建的角膜组织结构类似于天然角膜组织。结论：本实验可为角膜的病理生理、毒理、药理以及基因表达等研究提供有利的模型和工具。     

脱细胞异种角膜基质的制备及细胞相容性

目的用牛角膜制备脱细胞基质,作为组织工程角膜的载体,为细胞提供贴附生长的支持物.方法选取新鲜牛角膜9个,每个分层剥离为2片组织.用0.25%胰蛋白酶,37℃下分为20、40、60min消化,漂洗.每组取样本分别做扫描电镜观察和HE染色观察.其余冻干处理后消毒备用.将消毒后冻干牛角膜基质常规培养基浸泡24 h,取浸提液原液,稀释101、102、103倍培养人成纤维细胞,观察细胞生长情况.将冻干牛角膜基质复水,常规培养基浸泡24 h,以2×l05个/cm2接种兔角膜缘细胞,培养7 d后,标本扫描电镜检查、HE染色观察.结果电镜观察各组牛角膜片表层细胞均被脱去,60min组基质胶原间细胞碎片残留较少,20 min组较多,胶原纤维有序排列以60 min组破坏最大.浸提液的各稀释倍数及原液所培养人成纤维细胞生长良好,各组间差异无显著性.电镜及HE染色观察复合材料培养的兔角膜缘干细胞,均见细胞在材料表面贴附生长,材料部分表面呈多层生长.结论以酶消化法和冻干处理的脱细胞牛角膜基质可以作为细胞的载体在体外与细胞复合培养.     

培养角膜上皮和自体角膜缘移植治疗眼表损伤的比较

目的比较培养角膜上皮移植和自体角膜缘移植治疗严重眼表损伤的效果。方法对去除全角膜缘的新西兰大白兔行培养自体角膜上皮和自体角膜缘联合羊膜移植，观察术后角膜形态改变，并进行组织学和免疫细胞化学检测。结果培养角膜上皮移植后兔眼表面平整稳定，角膜中央无新生血管生长，自体角膜缘联合羊膜移植后兔眼表面不同程度结膜上皮化，两者治疗效果有显著性差异。结论培养角膜上皮移植能有效治疗以角膜缘干细胞受损为特征的严重眼表损伤。     

兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究

目的：用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法，行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼。方法：制作10只兔右眼于细胞缺乏的模型，取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养，并传代在无上皮细胞的人羊膜上。1个月后，手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮，7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植，另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜。结果：1周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合，传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周，角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上。移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子，术后早期都形成了角膜上皮化，并明显抑制了新生血管的再生，而接受羊膜移植的兔子，术后又出现明显的新生血管。结论：利用无上皮细胞的羊膜作为载体，培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长。     

家兔PRK术后角膜超微结构的实验研究

目的　评价实验性家兔不同屈光度 Ｐ Ｒ Ｋ 术后角膜创面愈合的过程。方法　应用 Ｓ Ｖ Ｓ Ａ Ｐ Ｅ Ｘ Ｐ Ｌ Ｕ Ｓ 型准分子激光治疗系统对６ 只家兔双眼进行 Ｐ Ｒ Ｋ 术。结果　透射电镜观察：术后３ ｄ ,角膜上皮细胞１ 层或２ 层覆盖切削区,角膜前基质胶原纤维排列紊乱。术后３０ｄ ,可见角膜上皮细胞增生,体积增大,细胞由正常的５ 层或６ 层增加到７ 层或８ 层;上皮细胞间可见桥粒连接,基底膜形成,但有不连续现象;上皮基底细胞于基底膜之间可见半桥粒。术后１００ｄ ,角膜上皮细胞基本恢复正常。扫描电镜观察：术后１００ｄ , 上皮细胞界限分明, 上皮明亮细胞较多,但微绒毛、微皱褶相对减少。结论　 Ｐ Ｒ Ｋ 术后１００ｄ 角膜组织结构基本正常,但仍有组织薄弱处和特殊性改变。 Ｐ Ｒ Ｋ 术后家兔角膜上皮微绒毛、微皱褶相对减少,可能是临床上 Ｐ Ｒ Ｋ 术后部分患者近期角膜干燥的原因之一。