破伤风毒素C端片段与心肌营养素-1融合蛋白表达、纯化与靶向神经元逆向运输及神经营养活性鉴定

目的 在BL21(DE3)大肠杆菌中表达破伤风毒素C端片段(TTC)与心肌营养素(CT)-1融合蛋白并纯化.探讨TTC转导结构域对CT-1的靶向神经元逆向运输活性与CT-1的神经营养活性.方法 异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导BL21(DE3)大肠杆菌表达CT-1/TTC融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与WB法鉴定融合蛋白表达.制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,分别经神经再生室、肌肉注射给药,自由放养1周后处死,4%多聚甲醛灌注固定,取脊髓L4～L6腰膨大标本,冰冻切片,免疫组织化学检测.制备新生6～7 d龄sD大鼠坐骨神经损伤模型,肌肉注射CT-1/TTC融合蛋白,自由放养1周后处死,4%多聚甲醛灌注固定,取L4～L6腰膨大标本,冰冻切片,尼氏染色计数脊髓前角运动神经元.结果 原核表达目的 蛋白CT-1/TTC表达量占全菌蛋白总量的15%,以可溶性蛋白为主.通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签亲和纯化获得2.7 g/L的CT-1/TTC重组融合蛋白.免疫组织化学于脊髓腰膨大检测到CT-1/TTC融合蛋白.坐骨神经损伤后,脊髓L4～L6腰膨大前角运动神经元计数较CT-1/TTC融合蛋白处理组减少,存活率下降.结论 基因重组CT-1/TTC蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,所获得的融合蛋白有靶向性脊髓神经元细胞的活性和对损伤后运动神经元的神经营养活性.     

塞来昔布对PC12细胞的凋亡作用及对血管内皮生长因子表达的影响

目的体外探讨COX-2抑制剂塞来昔布对PC12细胞的生长影响及血管内皮生长因子VEGF的表达的调控。方法应用噻唑蓝（MTT）比色法观察塞来昔布对大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞的生长抑制作用;Wrights-Giemsa染色法观察细胞形态学;流式细胞技术观察细胞在各时间点的凋亡率;Western blot检测VEGF-165蛋白的表达变化。结果塞来昔布呈时间、剂量依赖性抑制PC12细胞,24h半数抑制浓度（IC50）为100μmol/L;各点凋亡率均高于空白对照组;塞来昔布能抑制PC12细胞的VEGF-165蛋白表达,且跟时间正相关。结论 COX-2抑制剂塞来昔布能抑制PC12细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制VEGF蛋白表达。     

绿色荧光蛋白和大鼠睾丸AQP7融合蛋白表达载体构建及其表达

目的 :构建真核表达的pEGFP C1与大鼠睾丸AQP7的融合蛋白表达载体。　方法 :RT PCR的方法扩增Wistar大鼠睾丸AQP7cDNA编码区全长序列 ,测序鉴定 ,将AQP7cDNA融合于pEGFP C1基因的下游。以脂质体转染方法将pEGFP C1 AQP7融合蛋白转入中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞 ,应用免疫细胞化学方法和Western印迹技术对转染细胞株进行鉴定。　结果 :①Wistar大鼠AQP7cDNA序列登录到GenBank ,登录号 :AY15 7737;②通过鉴定证明CHO细胞已经稳定表达了pEGFP C1 AQP7融合蛋白 ,其相对分子质量为 5 30 0 0 ;③绿色荧光蛋白作为标记物观察到AQP7在CHO细胞的定位。　结论 :稳定表达pEGFP C1 AQP7融合蛋白的CHO细胞株的建立 ,为AQP7在细胞内定位与功能研究奠定了基础。     

基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造

目的：构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并人核实现细胞水平的基因敲除。方法：在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—SBP-Tat—EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS—Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b—SBP-Tat—NLS-cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌,经异丙基硫代一争I）I半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Westernblot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果：经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论：利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

靶向去唾液酸糖蛋白受体多功能分子的构建及抗肝癌效应

目的 构建具有靶向去唾液酸糖蛋白受体、溶酶体逃逸、DNA结合的多功能融合蛋白,并对表达产物进行功能鉴定.方法 合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链(GenBank:X02007),退火形成寡核苷酸双链;双酶切含抗去唾液酸糖蛋白单链抗体( ASGPR scFv) C1基因的载体C1/pIT2,0.7％低融点琼脂糖凝胶回收C1;以pSW50-Gal4为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增Gal4基因;采用分子克隆技术将其定向克隆至载体pGC4C26H中,获得重组质粒C1 MG/pGC4C26H;双酶切载体C1MG/pGG4C26H,胶回收片段C1MG定向克隆至载体pET-32c中,将含C1MG/pET-32c的BL21单菌落1∶100接种至1000 ml LB肉汤培养基中培养,并通过IPTG诱导表达.表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术( Western blot)和免疫组织化学分析重组蛋白C1 MG的抗原结合能力,溶血实验分析C1MG的生物学活性,肿瘤细胞生长抑制实验分析C1MG的DNA结合能力.结果 成功构建原核表达质粒C1MG/pET-32c,并经测序证实:在大肠杆菌BL21中有效表达重组融合蛋白C1MG;表达产物以包涵体形式存在;纯化的C1 MG大小为64.1 kDa,浓度为0.6g/L;Western blot结果说明C1MG能有效识别重组ASGPR,免疫组织化学结果证实C1 MG能结合到鼠肝细胞表面;溶血实验显示ClMG具有裂解红细胞膜功能;肿瘤细胞生长抑制实验证实C1 MG将pEBAF/tk-GAL4rec质粒有效地导入表达ASGPR的细胞中并表达TK基因,氯喹对肿瘤细胞生长抑制无明显影响.结论 在大肠杆菌中成功表达和纯化得到单链抗体-蜂毒肽-酵母转录因子(C1MG)的融合蛋白,该融合蛋白至少具有以下功能:ASGPR靶向识别能力、溶酶体膜裂解功能、以及DNA特异性结合功能,提示对肝癌的靶向治疗有潜在的应用价值.     

Cyr61蛋白表达载体的构建及表达

目的：体外表达并纯化Cyr61蛋白片段。方法：提取乳腺癌组织总RNA，用一步法RT—PCR选择扩增编码Cyr61蛋白的cDNA片段，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE80L中，转染大肠杆菌Rosetta—gami^TM2。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白，用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果：克隆到编码Cyr61蛋白片段的cDNA片段，其大小为930bp。构建的表达质粒PQE80-Cyr61经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为32kD的可溶性融合蛋白，经蛋白质印迹分析鉴定为Cyr61的融合蛋白。结论：本实验克隆了编码Cyr61蛋白片段的cDNA序列，并成功地获得了可溶性表达的融合目的蛋白，为进一步制备抗Cyr61蛋白的抗体和建立Cyr61蛋白定量检测方法创造了条件。     

免疫抑制剂对嗜铬细胞瘤12细胞和L929细胞增殖的影响

目的 初步探讨多种免疫抑制剂对嗜铬细胞瘤12（pheochromocytoma 12，PC12）细胞和L929细胞增殖的影响。方法 对数生长期PC12细胞和L929细胞传代，取细胞株复苏后第3代细胞均以1×10^6／ml密度接种于培养板中，分别加入10、10、10^-7和10^8mol／L环孢菌素A（cyclosporin A，CsA），10^-6、10^-7、10^-8和10^-9mol／LFK506以及10^-3、10^-4、10^-6和10^-8mol／L甲基强地松龙，并设立空白对照组。于培养24、48和72h后，取各浓度药物作用的细胞，采用MTT法检测细胞增殖。结果 高浓度（10mol／L）甲基强地松龙和较低浓度（10^-8～10^-7mol／L）CsA，在给药后48h内对PCI2细胞增殖有明显促进作用，此后促增殖作用不明显；而各个浓度的FK506均无促进PCI2细胞增殖的作用。高浓度甲基强地松龙（10^-3mol／L）和CsA（10^-6～10mol／L）作用24h后，对L929细胞增殖有显著抑制作用，FK506仅在较高浓度（10^-6mol／L）有一过性（仅出现于给药后48h）促进L929细胞增殖的作用。结论 10^-3mol／L甲基强地松龙和10^-8～10^-7mol／LCsA能够在短时间内促进PC12细胞增殖，而10^-3mol／L甲基强地松龙和10^-6～10^-5mol／L CsA对L929细胞增殖有显著抑制作用。     

营养剥夺诱导髓核细胞Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3表达及线粒体转位的实验研究

目的通过营养剥夺模拟体内髓核细胞退变微环境,检测Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3（Bcl-2/adenovirusE1B 19-kDa-interacting protein 3,BNIP3）表达及线粒体转位情况,为进一步探索髓核细胞退变死亡机制提供实验依据。方法成年清洁级SD大鼠2只,雌雄不限,体重150～200 g。体外分离获取鼠尾椎问盘髓核细胞,将传代后细胞分别置入正常环境（对照组:L-DMEM培养基、10%FBS、21%O₂）和营养剥夺环境（实验组:DMEM无糖无血清培养基、1%O₂）培养24、48、72 h后,实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测BNIP3基因及蛋白表达,流式细胞仪检测凋亡率及线粒体膜电位。结果实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测显示对照组细胞低表达BNIP3;实验组随培养时间延长,BNIP3表达呈上升趋势,且BNIP3与线粒体相结合;除培养后24 h实验组BNIP3基因表达与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）外,其余各时间点实验组BNIP3基因及蛋白表达与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示,对照组细胞凋亡率较低,且细胞保持较高的线粒体膜电位;而实验组随培养时间延长细胞凋亡率增加、线粒体膜电位降低,与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论营养剥夺可能通过诱导BNIP3表达增加并结合线粒体导致线粒体功能障碍,最终导致髓核细胞死亡。     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

Frequency of complications of manipulation of the spine

Summary A survey of all members of the Swiss Medical Association of Manual Medicine was undertaken for the year 1989. Informative data were given by 425 respondents on the frequency of complications of manipulation as related to the spine. The number of thoraco-lumbar manipulations during 1989 (225 working days) was 805 for each respondent, and the number manipulations of the cervical spine 354. Thus, the total number of thoraco-lumbar manipulations was 342 125, and the total number of cervical manipulations was 150 450. The overall incidence of side-effects of transient complications due to cervical spine manipulation such as disturbance of consciousness or radicular signs was 1: 16716. Seventeen patients (ratio 1: 20 125) after manipulation of the lumbar spine presented, in addition to increased pain, a transient sensorimotor deficit with precise radicular distribution. Nine of the 17 patients (ratio 1: 38013) developed a progressive radicular syndrome with sensorimotor defict and radiologically verified disc herniation and had to be referred for surgery. Side effects and complications of cervical and lumbar spine manipulation are rare. Taking in to account the yearly number of manipulations performed by a single physician in Switzerland and the rate of complications, it can be calculated that a physician practicing manual medicine will encoutner one complication due to manipulation of the cervical spine in 47 years and one complication due to lumbar spine manipulation in 38 years of practice. However, it is important that a careful clinical assessment is carried out to avoid complications due to manipulation carried out on the basis of inappropriate indications. Furthermore, the decision as to which technique is indicated for any particular functional disorder of the spine should be made on the basis of rational criteria resting on a knowledge of clinical biomechanics, functional anatomy and neurophysiology. The authors recommend a prospective morbidity study to be carried out among physicians, chiropractors, osteopaths and physiotherapists, taking into account the different indications and therapeutic techniques in relation to complications.     

Pathogenesis of carcinoma of the papilla of Vater

Most adenomas and carcinomas of the small intestine and extrahepatic bile ducts arise in the region of the papilla of Vater. In familial adenomatous polyposis (FAP) it is the main location for carcinomas after proctocolectomy. In many cases symptoms due to stenosis lead to diagnosis at an early tumor stage. In about 80%, curative intended resection is possible. Operability is the most relevant prognostic factor. Most ampullary carcinomas resp. carcinomas of the papilla of Vater develop from adenomatous or flat dysplastic precursor lesions. They can be sited in the ampulloduodenal part of the papilla of Vater, which is lined by intestinal mucosa. They also can develop in deeper parts of the ampulla, which are lined by pancreaticobiliary duct mucosa. Intestinal-type adenocarcinoma and pancreaticobiliary-type adenocarcinoma represent the main histological types of ampullary carcinoma. Furthermore, there exist unusual types and undifferentiated carcinomas. Many carcinomas of intestinal type express the immunohistochemical marker profile of intestinal mucosa (keratin 7–, keratin 20+, MUC2+). Carcinomas of pancreaticobiliary type usually show the immunohistochemical profile of pancreaticobiliary duct mucosa (keratin 7+, keratin 20–, MUC2–). Even poorly differentiated carcinomas, as well as unusual histological types, may conserve the marker profile of the mucosa they developed from. These findings underline the concept of histogenetically different carcinomas of the papilla of Vater which develop either from intestinal- or from pancreaticobiliary-type mucosa of the papilla of Vater. Molecular alterations in ampullary carcinomas are similar to those of colorectal as well as pancreatic carcinomas, although they appear at different frequencies. In future studies, molecular alterations in ampullary carcinomas should be correlated closely with the different histologic tumor types. Consequently, the histologic classification should reflect the histogenesis of ampullary tumors from the two different types of papillary mucosa.     

静脉皮瓣成活过程的实验研究

我们以兔为实验动物，通过微循环观察及血管内灌注填充剂，研究静脉皮瓣的成活过程。这一过程可分为２个阶段。第一阶段（术后７２小时内）为静脉血营养期：静脉血由静脉干通过小静脉吻合支、微静脉干间吻合支及终末微静脉吻合支回流至另一静脉。术后４８小时内毛细血管内无血液运动。第二阶段（术后７２小时～６周）为动脉血营养及血管改造期：术后７２小时新生血管开始向皮瓣内生长。术后７２无皮瓣动脉同主要来自皮瓣周围正常组织内的新生血管吻合使动脉血分布于整个皮瓣，这是静脉皮瓣成活的关键     

Oddi括约肌肌电活动实验模型的建立

目的建立研究Oddi括约肌肌电活动的动物模型和实验方法。方法将双极金属钩状电极通过浆膜层置入Oddi括约肌，记录不同条件干预下家兔的Oddi括约肌肌电活动信号，调整电生理实验参数并经放大、滤波及计算机处理后，对其大小、波形、幅度进行分析。结果不同条件干预下的家兔Oddi括约肌的肌电活动在波形、频率、幅度等方面均有明显的不同，具有明显的规律性。重复实验可得到相似的结果。结论使用双极金属钩状电极配以合理的电生理实验参数调整可以稳定地采集到在体的家兔Oddi括约肌肌电活动信号。这为今后广泛、深入地研究Oddi括约肌肌电活动搭建了一个技术平台。     

骨盆骨折的治疗进展

对于骨盆骨折的治疗 ,传统方法以卧硬板床 ,股骨髁上持续骨牵引 ,骨盆兜等保守治疗为主 ,常常引起下肢不等长 ,骶髋痛 ,步态失常等而严重影响生活质量 ,同时长期卧床易引发肺部感染、褥疮、应激性溃疡、泌尿系统结石等并发症而危及生命。下面就骨盆骨折的治疗进展作一综述。1     

Management of sequelae of septic arthritis of hip

A nine years old boy, who had suffered septic arthritis at the age of two years and presented now with a limp, hip instability, leg length discrepancy. The patient was treated by adductor tenotomy and upper tibial pin traction. When head remnant reached the level of the acetabulum, open reduction and Pemberton osteotomy was done to achieve cover of the femoral head. The purpose of this report is to highlight the six years followup of reconstruction of sequale of septic arthritis of hip joint.     

Catamnestic study of childless patients of the Department of Andrology of Hamburg-Eppendorf University Hosptal

By means of a questionnaire, we carried out a catamnestic study of 1419 patients with a complaint of infertility. 27 per cent of the replying patients reported about the birth of children. 343 patients (38%) reported about one or more conceptions. Compared with previous studies, this investigation shows better results of therapies. We interprete this to be caused in better possibilities of therapy, esp. the Kallikrein therapy.     

主动脉窦瘤破裂外科治疗的临床研究

目的　探讨主动脉窦瘤破裂局部病理改变及其合并主动脉瓣关闭不全的手术方法。方法　 3 6例主动脉窦瘤破裂 (RASV)合并主动脉瓣关闭不全 (AI) 15例、室间隔缺损 (VSD) 2 6例。补片修补 3 5例 ,其中合并VSD的均以一片法修补 ,合并AI的主动脉瓣置换 (AVR) 6例 ,主动脉瓣成形 4例。手术取材作病理检查 5例。结果　本组 3 6例中手术死亡 2例 ( 5 .6% )。存活的 3 4例病人均经门诊复查或通信随访 0 .3～ 18年 ,其中 2例死亡。病理检查见RASV合并VSD的瘤壁为纤维素样坏死或玻璃样变性。结论　主动脉窦壁纤维素样或玻璃样变性可能是其形成的病理基础。合并主动脉瓣关闭不全时应探查其病变程度 ,酌情一期矫正 ,瓣膜损伤明显时宜行主动脉瓣置换 ,对主动脉瓣环细小的病例 ,可借修补VSD和RASV的补片扩大主动脉瓣环。