代谢型谷氨酸受体7对人胚胎神经干细胞增殖的影响

目的 研究代谢型谷氨酸受体7(mGluR7)对人胚胎神经干细胞增殖的影响。方法 利用MTT比色法分析mGluR7过表达载体、mGluR7siRNA在不同时间对体外的人胚胎NSCs细胞活力的影响, 神经球测量方法分析mGluR7对人神经球生长的影响, 流式细胞术分析mGluR7对人NSCs细胞周期及细胞凋亡的影响。结果 MTT结果表明在处理24 h, 48 h和72 h后, mGluR7显著增强人NSCs的细胞活力, 增殖细胞数量显著增多, 神经球直径显著增大, mGluR7siRNA抑制人神经球的增殖。过表达mGluR7后, 与对照组相比G1/G0期和细胞比率显著下降, S期细胞比率显著上升, mGluR7过表达促进了细胞G1到S期转化, 沉默mGluR7将人NSCs细胞阻滞在G1/G0期。应用流式细胞术分析过表达mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响, 转染48 h后, 早凋晚凋均显著下降, 沉默mGluR7能够显著诱导人NSCs的早凋和晚凋。结论 mGluR7可促进体外培养的人胚胎皮质NSCs增殖。     

PTX阻断溶血磷脂酸对大鼠胚胎神经干细胞的促增殖作用

目的 观察溶血磷脂酸(lysophosphtidic acid,LPA)对大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的增殖的影响以及百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)对LPA作用的影响.方法 体外培养神经干细胞,对生成的神经干细胞球进行计数显示增殖情况.结果 ①在特殊的无血清培养液中加入低浓度LPA(0.01-1.0μmol/L)后,神经干细胞球数量呈剂量依赖性增加,表明LPA对NSCs有显著的促增殖作用;②培养液中同时加入LPA和PTX后,神经干细胞球计数显示LPA引起的NSCs的增殖被抑制了98%.结论 PTX阻断了LPA对大鼠胚胎神经干细胞的促增殖作用,从而推测LPA的促增殖作用可能主要通过PTX敏感的Gi-Ras-Raf-MAPK信号转导途径实现.     

丙戊酸钠通过p21调控大鼠神经干细胞的增殖

目的 探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对体外培养的成年雌大鼠脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 采用不同浓度的VPA(10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 mmol/L)作用于NSCs,CCK-8法检测在不同时间点(0、24、48、72 h)对细胞增殖的影响；VPA(10-5、l mmol/L)作用于NSCs 48 h后,流式细胞仪测定细胞周期分布,PCR测定p21在基因水平的表达,Western blot测定p21在蛋白质水平的表达.结果 CCK-8检测显示,当VPA浓度＞ 10-5 mmol/L时,体外培养的成年大鼠脊髓NSCs的增殖受到明显抑制,且具有时间依赖性.流式细胞仪细胞周期检测显示,同样浓度下,VPA可阻滞NSCs由G0/G1期向S期转换,表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞减少.PCR检测发现VPA可促进p21基因水平的表达.Western blot检测发现VPA可促进p21蛋白质水平的表达,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 VPA可能通过促进p21表达,使NSCs阻滞于G0/G1期,最终抑制NSCs增殖.     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

瞬时转染siRNA抑制大鼠神经干细胞内MMS2基因的表达

目的建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),沉默大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)内甲基磺酸敏感蛋白2(Methyl Methanesulfonate Sensitive 2,MMS2)的表达。方法设计并化学合成针对MMS2基因的3对siRNA分子序列,采用阳离子脂质体法瞬时转染NSCs,运用实时荧光定量PCR检测NSCs内MMS2基因mRNA的表达。结果 MMS2-siRNA对大鼠NSCs内MMS2基因的沉默效果在转染后36 h达到最大抑制作用;3对特异性MMS2-siRNA序列均有效地抑制了MMS2基因的表达,沉默效率分别为siRNA_A(58±5)%、siRNA_B(64±6)%、siRNA_C(84±3)%,与空白对照组相比均存在显著性差异(P<0.05);siRNA_C沉默效率最高。结论靶向MMS2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制NSCs内MMS2基因的表达,为后续相关研究提供实验方法。     

大鼠脊髓神经干细胞的体外培养及鉴定

目的:体外培养大鼠胚胎脊髓神经干细胞,观察其生长、增殖和分化特点.方法:利用倒置显微镜、MTT法、免疫细胞化学等方法检测神经干细胞的增殖、分化情况.结果:分离的脊髓神经干细胞呵形成大量悬浮的神经球,并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈nestin阳性.在添加10%胎生血清7 d后,神经球细胞可分化为有神经元、星形胶质细胞特异性抗原表达的细胞.结论:体外培养大鼠胚胎脊髓可得到大量神经干细胞,并能分化为神经元和星形胶质细胞.     

大鼠海马神经干细胞Brn-4基因的特异性siRNA研究

目的筛选出高效针对大鼠海马神经干细胞Brn-4基因沉默的特异性siRNA。方法设计4对抑制Brn-4基因表达的特异性siRNA序列,通过脂质体转染入体外培养的大鼠海马神经干细胞中,采用RT-PCR和免疫荧光检测转染细胞Brn-4基因的表达,筛选出沉默Brn-4基因最为有效的siRNA序列,并优化其转染条件。结果4对siRNA不同程度地阻断了海马神经干细胞Brn-4基因的表达,阻断效率最高的1^# siRNA最适转染剂浓度为0.5μmol/L,最佳转染时长为48 h。结论应用1^# siRNA可以高效率地沉默大鼠海马神经干细胞Brn-4基因的表达。     

低剂量辐射对胚胎鼠神经源干细胞增殖影响的体外实验研究

目的探讨低剂量辐射(LDR)对胚胎鼠神经源干细胞(NSCs)体外增殖的影响。方法从孕14 d SD大鼠中获得胚胎鼠NSCs并进行体外传代培养,并对LDR前后的细胞进行鉴定,将培养至对数期的细胞分成13组,即0、25、75、200 mGy各剂量照射后4 h、24 h、48 h、72 h,各组细胞分别采用台盼蓝拒染法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验及流式细胞仪方法检测细胞的增殖程度。结果胚胎鼠NSCs体外培养获得稳定传代的NSCs,在诸多辐射剂量和时间框内,以75 mGy照射后的24 h细胞增殖最明显,细胞的增殖指数(PI)最高,且照射前后细胞的鉴定结果显示LDR不会改变其分化潜能和原始状态。结论LDR体外可以刺激胚胎鼠NSCs的增殖效应。     

C6胶质瘤细胞对体外共培养大鼠神经干细胞增殖影响的初步研究

目的探索与C6胶质瘤细胞体外共培养后大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells NSCs）的增殖变化。方法分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。利用共培养池（cell culturetranswell inserts）建立两种细胞的体外共培养模型。应用相差显微镜及电镜观察各组共培养后NSCs的形态变化;共培养后NSCs MTT法作生长曲线。结果原代培养后获得神经干细胞及星形胶质细胞;与C6胶质瘤细胞共培养7天后的NSCs增殖较对照组快,电镜观察可见核质比增高,细胞器较发达。结论 C6胶质瘤细胞对体外共培养的大鼠NSCs的增殖有一定促进作用。     

氯化锂通过激活Wnt信号通路促进神经干细胞增殖

目的观察氯化锂（LiCl）作用于神经干细胞（NSCs）后对细胞周期等生物学性状的影响以及经LiCl处理过的神经干细胞在分化过程中Wnt信号通路的主要信号分子β-catenin、GSK-3β的表达改变,评估LiCl激活Wnt信号通路后对NSCs增殖和分化的影响。方法应用分离培养的NSCs体系,流式细胞仪检测不同浓度的LiCl（1、5、10、100mmol/L）处理48h后NSCs细胞周期等生物学性状改变,Western Blot检测LiCl处理后的NSCs中β-catenin、GSK-3β的表达以及动态变化。结果 LiCl处理后的NSCs体系细胞团块分散,呈悬浮状态生长,并能抑制血清诱导下的干细胞分化,分化细胞贴壁时间明显延长。流式细胞仪检测表现为S期、G2/M期细胞数百分比的增加和G0/G1期细胞数百分比的相对减少,其效应呈现一定的剂量依赖关系（P〈0.01）。Western Blot检测显示NSCs中的β-catenin分子在LiCl处理后表达明显增强,GSK-3β分子的表达明显下调,表现出正相关的量效关系（P〈0.01）。结论 LiCl通过激活Wnt信号通路能促进培养NSCs的增殖,抑制干细胞分化,其作用可能与胞内效应分子β-catenin的表达增多有关。     

鸟氨酸脱羧酶基因沉默对子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响

目的利用RNA干扰技术,观察鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞的沉默效应及对Ishikawa细胞增殖周期的影响。方法设计合成以鸟氨酸脱羧酶基因为靶向目标的siRNA序列质粒,利用脂质体介导的方法将质粒转染至子宫内膜癌Ishikawa细胞,实验分三组：Ishikawa组,pSUPER-EGFP组,pSUPER-EGFP-ODC组。用Real-time PCR和Western blot检测ODC的表达情况。采用MTT和流式细胞术来检测ODC基因沉默对Ishikawa细胞生长的影响。结果 Real-time PCR和Western显示pSUPER-EGFP-ODC组细胞ODC mRNA和蛋白质表达水平明显下降。MTT示pSUPER-EGFP-ODC能显著抑制Ishikawa细胞的增殖活性,与Ishikawa相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。流式细胞术结果示pSUPER-EGFP-ODC能显著阻滞Ishikawa细胞于G0/G1期,S期细胞数相应减少,并诱导细胞凋亡,与Ishikawa相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论转染靶向ODC基因的siRNA序列质粒能够下调ODC基因的表达,抑制人子宫内膜癌细胞Ishikawa在体外的增殖,阻滞Ishikawa细胞于G0/G1期并诱导细胞凋亡。     

Effect of siRNA targeted to fbxl20 on biological behavior of liver cancer SMMC-7721 cells

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响.方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbx120 mR-NA表达.结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbx120 mRNA的表达,沉默效率为71.49％.MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低.Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03％.流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21％)显著高于阴性对照组(71.49％)和空白对照组(67.90％).结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关.     

siRNA靶向沉默fbxl20基因对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响。方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbxl20 mR-NA表达。结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbxl20 mRNA的表达,沉默效率为71.49%。MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低。Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03%。流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21%)显著高于阴性对照组(71.49%)和空白对照组(67.90%)。结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关。     

Survivin基因沉默对脑胶质瘤C6细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Survivin基因沉默对脑胶质瘤细胞株C6体外细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法设计并合成针对Survivin基因的siRNA,构建Survivin-shRNA和阴性对照shcontrol慢病毒表达载体并感染脑胶质瘤C6细胞,用Western Blot法检测感染后C6细胞Survivin蛋白表达的抑制率,MTT法观察感染后24、48和72 h细胞增殖的变化,流式细胞术检测感染后48 h细胞凋亡和细胞周期的改变。结果 Survivin shRNA慢病毒载体感染C6细胞后Survivin蛋白的抑制率约为80%,阻滞C6细胞由G1期进入S期,抑制细胞的生长,增加了细胞的凋亡。结论 Survivin shRNA慢病毒表达质粒特异高效地抑胶质瘤C6细胞Survivin基因的表达,阻断C6细胞的细胞周期,抑制其增殖并促进凋亡。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性。方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34%BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的：体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor,aFGF）诱导其向神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化的可行性。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪（flow cytometry,FCM）测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）的表达。结果：大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34% BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论：全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

大鼠SLPI基因siRNA重组表达载体构建及其在调控真皮多能干细胞增殖中的作用

目的 观察分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)对真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)的促增殖作用.方法 酶消化法分离、纯化、扩增新生大鼠DMSCs.在前期成功构建SLPI基因过表达载体基础上,根据SLPI基因siRNA的设计挑选出最佳抑制SLPI基因表达的干扰载体,RT-PCR、Western blot鉴定.重组表达载体转染DMSCs,观察其表达,运用CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期,观察SPLI基因促进DMSCs的增殖作用.结果 成功分离获得真皮来源、具有细胞干性的DMSCs;并成功构建SLPI基因过表达真核载体及SLPI基因siRNA表达载体,转染DMSCs(分为过表达组和干扰组,并以转染空载体者为对照组).CCK-8检测显示,48、72、96 h,过表达组增殖较快,干扰组增殖较慢,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);72、96 h,过表达组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),说明过表达组增殖较快,即SLPI基因有促进增殖作用.流式细胞检测表明,过表达组G1期与干扰组比较差异有统计学意义(P＜0.05),S期、G2期与对照比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SLPI基因具有明确的促DMSCs增殖作用,促进细胞从G1向S和G2期转变,即通过调控细胞周期发挥促增殖作用.     

siRNA沉默PCSK6基因对胶原诱导性关节炎的影响

目的 探讨siRNA沉默PCSK6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。方法 采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的siRNA oligo-433干扰剂、siRNA oligo-688干扰剂、siRNA oligo-2506干扰剂特异性抑制PCSK6在CIA FLS中的表达,阴性siRNA为阴性对照组,瞬时转染24、36 h后,采用RT-qPCR法检测抑制效率,同时检测PCSK6基因沉默后各相关基因的表达;采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰PCSK6表达后对细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。结果 转染特异性siRNA-PCSK6后,各干扰组与阴性对照组相比,siRNA oligo-2506干扰剂转染24 h时,PCSK6 mRNA水平抑制效果显著(P<0.001),CIA FLS的增殖受到抑制(P<0.001),细胞的侵袭和迁移能力下降(P<0.001),肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P<0.001),G₀/G₁期的细胞数目增多(P<0.05),PCSK6下游基因CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表达均明显下降(P<0.05)。结论 PCSK6基因沉默对CIA FLS的生物学行为具有一定作用,为进一步研究CIA发病机制奠定基础。     

siRNA沉默c－myc对肾上腺皮质癌SW－13细胞增殖的影响

目的：应用siRNA干扰肾上腺皮质癌SW－13细胞c－myc基因的表达,探讨siRNA沉默c－myc对肾上腺皮质癌细胞增殖的影响。方法将siRNA－c－myc转染入SW－13细胞中,采用荧光定量PCR和Wes-tern blot检测转染后c－myc的表达,MTT分析SW－13细胞的增殖,荧光定量PCR检测转染后FHIT在SW－13细胞中的表达。结果 c－myc mRNA在转染48 h后明显下降,c－myc蛋白在转染72 h后明显下降。 SW－13细胞增殖能力在转染24 h后开始下降,48 h和72 h后受到明显抑制。沉默c－myc基因后,FHIT在SW－13细胞的表达有所升高。结论 siRNA沉默c－myc使肾上腺皮质癌细胞增殖受到抑制。 siRNA沉默c－myc基因为肾上腺皮质癌的靶向治疗提供新的理论依据。