小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

LHScDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

目的：克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段Ｌ２的基因ｃＤＮＡ序列,并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法：将Ｌ２在ＧｅｎＢａｎｋ中拼接后,分析其序列结构,并构建正义真核表达质粒,转染ＢＥＬ－７４０２肝癌细胞后,对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果：克隆得到一条１００５ｂｐ的ｃＤＮＡ,其５’端７１２ｂｐ与人Ｌｉｐｒｉｎβ１ｃＤＮＡ５’端调控序列和外显子１,２,３序列同源（１００％）,而３’端２９３ｂｐ与Ｌｉｐｒｉｎβ１基因内含子４同源（１００％）。其间有一个５１０ｂｐ开放阅读框架,起始密码位置与Ｌｉｐｒｉｎβ１基因相同,推断的蛋白产物除Ｃ端１３个氨基酸残基外,其余均与Ｌｉｐｒｉｎβ１同源。此ｃＤＮＡ暂命名为ＬＨＳ（Ｌｉｐｒｉｎβ１－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。ＬＨＳ ｃＤＮＡ     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ｃＤＮＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。结果表明，ｐ１６原核表达载体构建成功并表达出ｐ１６非融合蛋白。     

pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了一种编码β－半乳糖苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。ｐＢＬａｃＺ作为一种新的标志基因载体，可能具有一定的应用价值。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

分泌型磷脂酶A2 cDNA与载体pRc／CMV定向克隆及表达

为了构建分泌型磷脂酶Ａ２（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２,ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的有效表达系统,该文从无效表达的重组体ｓＰＬ０Ａ２－ｐＧＥＭ７中制备ｓＰＬＡ２片段,将其插入中间载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＢＳＳＫＲ的ＥｃｏＲ１位点,利用ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体转化ＤＨ１感染态细胞,筛选ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体,应用Ｘｂａｌ、Ｈｉｎｇｄ３双酶消化该重组体并回收     

pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了一种编码β－半乳苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。     

人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选

目的探讨如何在无药物抗性改变;无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白原核表达载体。方法在 ＩＦＮ－α基因两端加上 ＸｂａⅠ酶切位点后用 ＰＣＲ法扩增,再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体的相应位点上,构建 ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。取 ＰＣＲ扩增得到的 ＩＦＮ－α ＤＮＡ,用地高辛标记系统进行化学标记,制备 ＩＦＮ－α ＤＮＡ探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌．增菌后,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体 ＤＮＡ,点样于硝酸纤维膜上, ８０℃烤２ｈ,预杂交液 ４２℃,２ｈ膜预杂交,标记探针 ４２℃, ４ｈ杂交,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗 ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体为阴性对照, ＩＦＮ－α质粒为阳性对照。阳性克隆再以 ＳａｃＩ和 ＸｂａⅠ酶切,琼脂糖电泳鉴定。结果４０株转化细胞中筛选出７个阳性克隆,酶切鉴定显示两者符合率达１００％,成功地筛选出了ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。结论人源ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载     

肺表面活性物质结合蛋白B和C在大肠杆菌中的表达

用基因工程方法表达出肺表面活性物质结合蛋白（ＳＰ）－Ｂ和ＳＰ－Ｃ，与人工合成磷脂制备成有效的外源性肺表面活性物质，以便今后用于治疗呼吸窘迫综合征。方法用人ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ基因的成熟多肽构建原核细胞表达载体ｐＩＮ－Ⅲ－ｏｍｐＡ２－Ｂ－Ｃ，在大肠杆菌ＢＬ２１中，通过异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，并用膜天平检测表达产物的生物活性。结果ＳＰ－Ｂ和ＳＰ－Ｃ融合蛋白可以在大肠杆菌ＢＬ２１中表达，分子量约为２００００，但表达量较低。在大肠杆菌中，表达产物能使表面张力降低，最小表面张力可以达到０．００４Ｎ／ｍ２，且有较大滞后环面积。结论为今后通过基因工程方法获得ＳＰ，从而制备理想的外源性肺表面活性物质制剂创造了条件。     

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增，双酶消化上     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病？…

目的 为使外源性ＴＮＦ,ＩＦＮ基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类ＭＨＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效应,构建在ＨＬＡ－Ｂ７启动子调控、ＩＲＥＳ连接下协同表达ＴＮＦα和ＩＦＮβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果 从ｐＧＬ３Ｂ７ＴＮＦ及ｐＩＲＩＦ中切下Ｂ７ｐｒｏ－ＴＮＦ和ＩＲＥＳ－ＩＦＮβ基因片段,先后插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ（＋）,构建成ｐＢＬＢ７ＴＮＩＲＩＦ。回收ＴＮＦα－ＩＲＥＳ     

细胞癌基因c-myc、c-fos蛋白产物在人胎儿内耳的定位表达

利用免疫组织化学技术对胎龄为９．５～２９周的１０例人胎儿内耳中ｃ－ｍｙｃ和ｃ－ｆｏｓ蛋白产物的表达情况进行研究。免疫组织化学染色采用ＬＳＡＢ方法并参考Ｓｈｉ等火棉胶包埋人颞骨切片免疫组化染色技术。结果发现：ｃ－ｍｙｃ蛋白产物在所有胎儿Ｃｏｒｔｉ＇ｓ器中的毛细胞、支持细胞均有较强的表达；Ｃｏｒｔｉ＇ｓ器在发育成熟后表达也无减弱趋势，但支持细胞仍维持较强的表达；螺旋神经节神经元有阳性表达，血管纹、螺旋凸及内耳其它一些结构的细胞也有表达。前庭斑和壶腹嵴感觉上皮也有ｃ－ｍｙｃ蛋白产物表达，但后期毛细胞染…     

重组γ干扰素的表达与纯化

目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化方法,为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用ＤＮＡ重组技术把中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到析核表达质料ｐＢＶ２２０上,构建出ｐＢＶＩＦＮ高效表达载体,转化大肠杆菌ｐｌｙｓｓ。通过温度诱导,高效表达ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ。然后,经过包涵体溶解、复性、浓缩及ＤＥＡＥ离子交换层析,使γ干扰素纯化。结果 ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ表达水平占菌体     

转化生长因子β1在cos—7细胞中的短暂表达

本文将人转化生长因子β１（ｈＴＧＦβ１）全长ｃＤＮＡ克隆至真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的ＮｈｅＩ位点，利用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法将ｈＴＧＦβ１载体导入ｃｏｓ－７细胞中。实验结果表明：所构建的表达载体在ｃｏｓ－７细胞内有转录水平的表达，这为我们进一步研究ｈＴＧＦβ１在其它细胞内的表达与调控之间的关系奠定了基础。     

C－erbB－2癌基因产物的表达在乳腺癌诊断及预后方面的意义

Ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因产物的表达在乳腺癌诊断及预后方面的意义ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＰｒｏｇｎｏｓｉｓＷｉｔｈＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ－ｅｒｂＢ－２ＯｎｃｏｇｅｎｅｉｎＨｕｍａｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒ￥／／乐承艺（病理...     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的：利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ ＨＴ杆状病毒系统在Ｓｆ９昆虫细胞中表达庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）ＮＳ３蛋白,并对表达产物的免疫原性进行研究。方法：将ＨＧＶ ＮＳ３基因片段定向克隆至转座载体ｐＥａｓｔＢｓｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,用抗生素平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染Ｓｆ９昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液,将上清液再次感染Ｓｆ９细     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

抑癌基因MTS1真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系 …

目的：构建多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）的真核表达载体的构将其转入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础。方法：利用ＢａｍＨⅠ与ＥｃｏＲⅠ从ｐＵＣ１９－ｐ１６质粒上下ＭＴＳ１ ｃＤＮＡ片段并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,构建成ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６导入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中;采用ＡＢＣ法对转染后的不同代数细胞