组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

组织工程化皮瓣构建的初步研究

应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论 分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

组织工程化皮瓣的构建

摘要：目的应用脂肪组织来源干细胞（ASCs）在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组
织工程化皮瓣。方法（1）构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并
进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。（2）构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮
细胞（Kc）和成纤维细胞（Fb）。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液
界面继续培养10 d形成复合皮。（3）构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结
构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果（1）ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂
诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。（2）经过气-液界面培养后,
Kc成层分化,形成基底上层。（3）组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞
聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组
装培育,可构建出组织工程化皮瓣。
     

人角质形成细胞库的建立

目的探索人皮肤表皮细胞分离、培养、传代、冻存及复苏技术.方法采用细胞培养技术及免疫组化染色鉴定技术.结果采用细胞培养技术体外分离培养了小儿包皮表皮细胞,培养的表皮角质形成细胞,经冻存、复苏后,此角质形成细胞仍既能增殖,又能分化,生长状态与新鲜分离的角质形成细胞相类似.结论酶消化法是快速大量培养表皮细胞的简便易行的方法.     

annexinⅡ在人表皮角质形成细胞分化中的表达

目的: 探讨annexinⅡ在正常人表皮角质形成细胞(normal human epidermal keratinocytes, NHEK)分化中的表达. 方法: ①体外培养NHEK,采用无血清无钙离子的角质形成细胞生长培养基(KGM),通过改变培养基中的钙离子浓度来调节NHEK的增殖和分化,采用免疫细胞化学(ICC)技术分别检测annexinⅡ在增殖和分化NHEK中的表达. ②采用免疫组织化学(IHC)技术检测成人及新生儿表皮NHEK中annexinⅡ蛋白的表达. 结果: ①低钙(0.07 mmol/L)培养条件下,annexinⅡ呈弱阳性表达,且主要分布于核周. 高钙(1.5 mmol/L)条件下培养24 h后,annexinⅡ仍呈弱阳性表达,但表达的部位出现明显变化,主要分布于细胞间;48 h后,annexinⅡ于胞质及胞膜均呈强阳性表达. ②人正常皮肤切片的IHC结果显示:annexinⅡ主要分布于基底上层的分化NHEK中. 结论: annexinⅡ可能参与人表皮NHEK分化的调控.     

在体诱导表皮细胞去分化的初步实验研究

目的 在体诱导表皮细胞去分化,探索与表皮细胞去分化有关的信号通路.方法 包皮皮片去除皮下组织,用中性蛋白酶分离表皮,Ⅳ型胶原反复粘贴并牵拉表皮去除基底细胞层.处理后表皮片移植于裸鼠全层皮肤下,分别于3、5、7 d取出移植皮片,采用免疫组织化学染色、流式细胞仪检测、Western blot和RT-PCR等方法检测皮片移植前后表型的改变和ERK MAPK通路各信号分子表达的变化情况.结果 去基底细胞层处理的表皮片干细胞标志物CK19和β1整合素染色阴性;移植后5 d,存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布.流式细胞仪检测结果显示,表皮片移植后CK19阳性细胞和β1整合素阳性细胞由移植前的0.00%分别增加到7.54%和5.24%,而CK10阳性细胞由99.62%下降为86.56%.Western blot和PCR检测也证实CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表达在移植后明显增强.ERK及上下游信号分子(p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2和c-myc)表达增强.t-MEK1/2和t-ERK1/2移植前后表达无显著差异(P＞0.05).结论 处于终末分化阶段的表皮细胞可以向干细胞状态逆转,这个过程可能与ERK MAPK信号通路有关.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

人表皮细胞的体外培养

目的：对表皮细胞在不同的培养方法、不同的培养液及不同底物中的生长情况进行３方面的探讨，以便选出较好的一种组合进行表皮细胞培养，为改善烧伤皮源不足的问题打下基础。方法：①采用人包皮或体皮制成皮块、皮粒、表皮细胞悬液进行液体培养，比较３种方法中表皮细胞生长情况；②应用纯表皮细胞悬液进行空气液体界面培养，平铺平皿培养及培养瓶液体培养，比较表皮细胞贴壁、生长情况；③另将表皮细胞悬液接种于３种不同的培养液，即ＲＰＭＩ１６４０，ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ及ＭＥＭ比较细胞生长差异。结果：①在适当的条件下，离体的皮肤皮块、皮粒及表皮细胞悬液经培养皆能生长和分化，而表皮细胞悬液生长速度较快，纤维母细胞污染机会最少；②以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面法，细胞生长速度最快，培养出的单层表皮细胞膜片易取出，不收缩；③表皮细胞在ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０及ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ３种培养基中的生长情况基本一致。结论：以Ｂｉｏｆｉｌ为底物的空气液体界面培养法应得到推广应用，它不仅加快了表皮细胞的生长速度，减少了纤维母细胞的污染，易于移植，同时解决了以往各种人工敷料仅针对Ⅱ度烧伤创面的治疗及暂时覆盖Ⅲ度创面的局限     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法.方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照.结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达.结论:运用Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养.     

胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定

目的:建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法,探讨神经干细胞的基本生物学特性.方法:取孕14 d胎鼠大脑皮层,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞.结果:从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白(Nestin)免疫阳性并能在体外传代培养,血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白,诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin.结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,属于中枢神经系统的神经干细胞.     

在空气—液体交界面培养角朊细胞

为使体外培养的角朊细胞在近似体内状况下生长,本实验将人体表皮角朊细胞置于塑料培养环内的胶原基质上进行空气—液体交界面培养。培养14d后,将培养物冰冻切片,行普通细胞染色和免疫细胞化学检查,结果显示,有多层细胞形成,且在上层细胞中出现filaggrin。提示此培养技术可用于研究人体表皮细胞的生长和分化。     

人工皮肤培养模型的建立

模拟体内生理条件,采用细胞三维培养技术将角朊细胞接种在一活性真皮替代物（即成纤维细胞胶原凝胶）上,然后行气液界面培养,使角朊细胞的一些正常生长和分化的特殊提以再现,从而形成一种能应用于临床的人工皮肤。而且这一培养模型使角朊细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成了一有机的整体,因而也是研究表皮分化、其表皮间相互关系的良好模型。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

复合壳多糖人工皮肤的初步实验研究

目的探讨复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层角蛋白的表达以了解移植后皮肤表皮的分化情况.方法分别将复合壳多糖人工皮肤移植前、移植后1个月、移植后2个月、正常人皮肤、正常兔皮肤石蜡块切片,用抗广谱角蛋白多抗、抗角蛋白K5和K10单抗进行免疫组化染色,观察表皮层角蛋白的表达和表皮分化情况.结果复合壳多糖人工皮肤移植后1个月及2个月表皮层均有较强的角蛋白表达,与正常皮肤相似;基底层以上细胞有角蛋白K10表达,且越接近表皮表面表达越强,与正常人皮肤相似,基底层细胞有角蛋白K5表达,但明显弱于正常人皮肤.结论复合壳多糖人工皮肤移植家兔后表皮层均有角蛋白表达,有增生性细胞和分化细胞,表皮分化良好、层次清楚,与正常皮肤相近.     

表皮角质形成细胞分化中tPA分泌的研究

目的探讨表皮角质形成细胞中,tPA分泌的变化及其对细胞分化的影响.方法利用免疫细胞化学、酶联免疫吸附测定等方法,检测高浓度Ca2 作用下,培养的小鼠分化表皮角质形成细胞表面及培养上清中tPA表达的变化.结果高Ca2 浓度下,KC分化标记物K10在培养24h即有较强的表达,与此同时,在培养上清中检测到大量分泌tPA;培养24h以后,随着培养时间的延长,KC培养上清中分泌tPA的含量呈现出降低趋势,KC表面tPA量则呈现出增加趋势,当有L-精氨酸存在时,上述两种趋势均明显减弱.结论小鼠表皮KC分化过程中存在tPA的分泌,分泌tPA能通过其赖氨酸位点进一步吸附于KC表面,进而促进KC的分化.     

皮肤创伤修复中uPA/uPAR的表达及作用的研究

目的：探讨皮肤创伤修复中uPA/uPAR的表达规律及意义。方法：应用免疫组化,Western Blot细胞培养,ELISA等方法检测小鼠皮肤伤缘和培养的单层角质形成细胞创伤模型的uPA/uPAR的表达。结果：创伤后uPA/uPAR的表达增高,伤后12－24h uPA/uPAR的表达高峰。结论：创伤促进了uPA/uPAR的表达,伤后uPA/uPAR的表达增高促进了皮肤创伤愈合表皮再生过程。     

组织工程化表皮膜片修复裸鼠创面的实验研究

目的 构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于修复裸鼠全层皮肤缺损创面。方法 体外分离、培养、扩增人类表皮细胞，与壳聚糖—明胶膜构建表皮细胞膜片，用于修复裸鼠背部全层皮肤缺损创面，以单纯壳聚糖／明胶膜作为对照；术后行大体、组织学观察及免疫组织化学检测。结果 表皮细胞可以壳聚精—明胶膜作为载体在体外培养，达到60％～70％亚融合状态时，移植人表皮细胞／壳聚糖—明胶膜到裸鼠全层皮肤缺损创面，人表皮细胞可以在创面存活并继续增殖分化，形成连续的表皮覆盖创面。结论 人表皮细胞／壳聚糖—明胶膜是一种理想的组织工程表皮替代物。     

Constructing skin-equivalents using hair follicle stem cells

Objective： To establish the method of constructing skin-equivalents （SE） using hair follicle stem cells （HFSC）. Methods： K19 positive cells derived from hair were cultivated using serum-free medium KGM and seeded on dermal equivalents （DE）. After the culture between the air-liquid interface for 14 days, SE were harvested and used for evaluation. Results： K19 positive cells chosen as HFSC were located in bulge of out root sheet in hair follicle. Cultivated HFSC could build a fully developed, multi-layered epidermis on the basis of DE, resembling the skin structure. Conclusion： HFSC located in out root sheet can differentiate into kerafinocyte in vitro and be used for SE construction.