组织工程化表皮膜片修复裸鼠创面的实验研究

目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于修复裸鼠全层皮肤缺损创面.方法体外分离、培养、扩增人类表皮细胞,与壳聚糖-明胶膜构建表皮细胞膜片,用于修复裸鼠背部全层皮肤缺损创面,以单纯壳聚糖/明胶膜作为对照;术后行大体、组织学观察及免疫组织化学检测.结果表皮细胞可以壳聚糖-明胶膜作为载体在体外培养,达到60%～70%亚融合状态时,移植人表皮细胞/壳聚糖-明胶膜到裸鼠全层皮肤缺损创面,人表皮细胞可以在创面存活并继续增殖分化,形成连续的表皮覆盖创面.结论人表皮细胞/壳聚糖-明胶膜是一种理想的组织工程表皮替代物.     

组织工程化表皮膜片的构建及其在增殖性疤痕治疗中的应用

目的 构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于增殖性疤痕治疗。方法 利用患者少量自体正常皮肤分离、培养、扩增表皮细胞,接种于壳聚糖-明胶膜构建成表皮细胞膜片;断层削除增殖性疤痕,膜片移植于创面、适度加压,术后10、30、90 d行大体观察、组织学检查及广谱角蛋白、包壳蛋白、层粘连蛋白免疫组织化学检测。结果 利用自体表皮细胞和壳聚糖/明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床增殖性疤痕治疗6例,经过3月随访,创面愈合时间(16.2±15)d,移植膜片存活良好,结构较完整,90 d随访无明显疤痕增生,疗效肯定。结论 表皮细胞/壳聚糖-明胶膜片对增殖性疤痕具有良好治疗效果,组织工程皮肤进入临床具有现实的可行性及广阔的应用前景。     

组织工程化表皮膜片的构建及其在增殖性疤痕治疗中的应用

目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于增殖性疤痕治疗.方法利用患者少量自体正常皮肤分离、培养、扩增表皮细胞,接种于壳聚糖-明胶膜构建成表皮细胞膜片;断层削除增殖性疤痕,膜片移植于创面、适度加压,术后10、30、90 d行大体观察、组织学检查及广谱角蛋白、包壳蛋白、层粘连蛋白免疫组织化学检测.结果利用自体表皮细胞和壳聚糖/明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床增殖性疤痕治疗6例,经过3月随访,创面愈合时间(16.2±15)d,移植膜片存活良好,结构较完整,90 d随访无明显疤痕增生,疗效肯定.结论表皮细胞/壳聚糖-明胶膜片对增殖性疤痕具有良好治疗效果,组织工程皮肤进入临床具有现实的可行性及广阔的应用前景.     

组织工程皮肤修复动物皮肤缺损的实验研究

目的利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建组织工程皮肤，探讨其用于修复动物皮肤缺损的可行性。方法将扩增的人表皮细胞复合异种（猪）脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤，将制备的人工皮肤移植于裸鼠全层皮肤缺损，观察创面愈合情况并进行直接免疫荧光鉴定。结果构建的组织工程皮肤可用于修复裸鼠全层皮肤缺损，创面愈合良好，新生的表皮由移植的人表皮细胞增殖形成。结论利用表皮细胞复合脱细胞真皮构建的组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。     

含黑色素细胞的表皮替代物构建及对色素脱失的疗效

目的联合应用黑色素细胞和表皮细胞构建组织工程化表皮替代物,并应用于色素脱失治疗。方法利用幼儿包皮分离、培养和扩增出表皮细胞和黑色素细胞,接种于壳聚糖明胶膜,构建成含黑色素细胞的表皮膜片。建立裸鼠动物模型,将含黑色素细胞的表皮膜片移植于治疗组的受区,同时设立表皮细胞膜片为对照组。术后定期行大体观察、组织切片HE染色、抗S-100蛋白免疫组化染色,以检测黑色素细胞在创面的成活情况。结果联合应用人黑色素细胞和表皮细胞接种于壳聚糖/明胶膜能够构建出含黑色素细胞的表皮替代物,并应用于动物实验,检测出黑色素细胞成活良好。结论联合应用人黑色素细胞和表皮细胞接种于壳聚糖/明胶膜的表皮替代物能使色素脱失的动物模型恢复色素功能,对色素脱失具有良好的治疗效果。     

含黑色素细胞的表皮替代物构建及对色素脱失的疗效

目的 联合应用黑色素细胞和表皮细胞构建组织工程化表皮替代物,并应用于色素脱失治疗.方法 利用幼儿包皮分离、培养和扩增出表皮细胞和黑色素细胞,接种于壳聚糖明胶膜,构建成含黑色素细胞的表皮膜片.建立裸鼠动物模型,将含黑色素细胞的表皮膜片移植于治疗组的受区,同时设立表皮细胞膜片为对照组.术后定期行大体观察、组织切片HE染色、抗S-100蛋白免疫组化染色,以检测黑色素细胞在创面的成活情况.结果 联合应用人黑色素细胞和表皮细胞接种于壳聚糖/明胶膜能够构建出含黑色素细胞的表皮替代物,并应用于动物实验,检测出黑色素细胞成活良好.结论 联合应用人黑色素细胞和表皮细胞接种于壳聚糖/明胶膜的表皮替代物能使色素脱失的动物模型恢复色素功能,对色素脱失具有良好的治疗效果.     

复合培养人工皮移植12例疗效观察

目的 在体外培养表皮细胞及成纤维细胞并与人工真皮复合培养,用以修复患者皮肤缺损创面.方法 从12例皮肤缺损患者体表切取皮肤标本,分离成单个表皮细胞和小块真皮组织进行体外培养、增殖,将收获的表皮细胞和成纤维细胞与人工真皮复合培养,形成人工皮,移植于患者皮肤缺损创面.结果 复合培养人工皮能存活,形成皮肤替代物,皮肤缺损创面得以修复.结论 复合培养人工皮能在新鲜创面上存活,形成皮肤替代物,性质比单纯培养表皮细胞膜片移植效果好,比自体皮片扩增速度快.     

体外构建的皮肤模型Inspectskin Ⅰ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础。【方法】将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察。【结果】移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构、汗腺样结构和毛囊样结构。免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性。【结论】体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮、汗腺样结构和毛囊样结构的潜能。     

体外构建的皮肤模型InspectskinⅠ修复裸鼠全层皮肤缺损

【目的】 探讨胚胎来源表皮干细胞构建的人工皮肤模型InspectskinⅠ修复全层皮肤缺损的作用,为构建含皮肤附属结构的检验用皮肤奠定基础｡ 【方法】 将人羊膜和BMP-4定向诱导小鼠胚胎细胞分化为表皮干细胞,采用筏式培养在体外与PHBV和成纤维细胞共培养构建组织工程皮肤,经短暂培养后移植于裸鼠皮肤缺损创面,对移植物进行形态学和免疫组织化学观察｡ 【结果】 移植物可封闭皮肤缺损,在其表面可形成复层表皮样结构,真皮部分可见大小不等的由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构､汗腺样结构和毛囊样结构｡免疫组化和免疫双标结果表明新生表皮的基底层分别呈CK19和CK10阳性,腺管样结构分别呈CEA和CK18阳性｡ 【结论】 体外重建的人工皮肤能修复裸鼠全层皮肤缺损,胚胎来源表皮干细胞具有分化为复层扁平上皮､汗腺样结构和毛囊样结构的潜能｡     

黑色素细胞与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化皮肤

目的 探讨构建含有黑色素细胞组织工程化皮肤的方法.方法 从人包皮组织中获取黑色素细胞,从人骨髓中获取骨髓间充质干细胞(BMSCs),以二者为种子细胞,按照1:10的比例混和培养,并与I型胶原膜复合体外构建组织工程化皮肤,对裸鼠创面进行修复.通过大体标本观察、4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)体内示踪标记、HE染色、免疫组织化学检测及透射电镜观察等方法,观察组织工程化皮肤修复裸鼠皮肤创面缺损及黑色素细胞的分布情况.结果 裸鼠创面皮肤生长良好,DAPI体内示踪标记、免疫组织化学检测S-100蛋白及透射电镜观察可以发现黑色素细胞以正常的组织结构形式分布于创面皮肤.结论 黑色素细胞与BMSCs通过适当的比例及体外条件培养,与I型胶原膜复合可以在体外构建出具有黑色素细胞的组织工程化皮肤.     

去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损

目的利用去细胞羊膜负载毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤缺损。方法体外分离和培养人毛囊干细胞,取经慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGC FU-GFP-Lentiviru）标记后第4代毛囊干细胞接种于去细胞羊膜上;负载后第7天,HE染色光学显微镜观察细胞黏附生长情况。于18只C57BL/6裸鼠背部制作全层皮肤缺损创面,并根据不同的处理方式分为实验组（将负载毛囊干细胞的去细胞羊膜植入裸鼠全层皮肤缺损创面）、去细胞羊膜移植＋干细胞注射组（将去细胞羊膜覆盖创面后羊膜下注射5×106毛囊干细胞）和去细胞羊膜移植组（去细胞羊膜单独移植）,每组6只。分别于移植后第7、14、21、28天,测量各组创面面积并计算创面收缩率。移植后第28天,荧光显微镜观察创面组织绿色荧光蛋白（GFP）表达,HE染色光学显微镜观察新生皮肤结构特征。结果去细胞羊膜负载毛囊干细胞后第7天,HE染色光学显微镜观察发现,细胞连接成片状覆盖于去细胞羊膜表面。实验组和去细胞羊膜移植＋干细胞注射组移植后各时点的创面收缩率均显著小于去细胞羊膜移植组（P〈0.05）。移植后第28天,荧光显微镜观察显示实验组创面表皮层GFP表达阳性;HE染色光学显微镜观察发现实验组创面组织表皮层明显增厚,有类似毛囊样结构生成。结论去细胞羊膜负载毛囊干细胞可用于修复裸鼠全层皮肤缺损。     

人皮肤真皮在增生性瘢痕形成中作用的实验研究

目的验证人皮肤真皮层在增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)形成中的决定作用,探讨HS的发病机制.方法在裸鼠背部体表分别移植人的全厚皮片、刃厚皮片和中厚皮片,以及大鼠的全厚皮片,观察皮片干痂脱落后局部瘢痕增生的大体情况及组织学变化.结果只有移植人的全厚皮片才会发生明显的瘢痕增生,而移植人的刃厚皮片以及大鼠的全厚皮片则根本不发生瘢痕增生,移植人中厚皮片虽然部分可以发生一定程度的瘢痕增生,但增生程度及发生率均明显不如移植人的全厚皮片.结论人皮肤内在的因素是HS发生的决定因素,这种决定因素存在于人皮肤的真皮层.     

Membrane cell grafts, fresh and frozen to cover full thickness wounds in athymic nude mice

objective: To find a new way to cover full-thickness wounds. Methods: Biobrane(r), an adherent, flexible temporary wound dressing was incubated with cultured human keratinocytes. The cells adhered quickly forming "membrane-celgrafts" (MCG). Some of the grafts were frozen and after thawing viability was verified with a XTT colorimetric assay.MCGs, fresh and cryopreserved, were transplanted on full thickness wounds created on athymic nude mice. Conventional cultured epidermal grafts (CEG) and wounds without cell grafts served as control. Results: MCGs resulted in a differentiated epithelium of human phenotype and immunohistochemistry, immunofluorescence and electronmicroscopy were performed.Compared with CEG-grafted sites a reduced wound contraction was noticed and complete remodelling of the basement membrane zone was found. Conclusion: The efficiency of the easy, uncomplicated production, cryopreservation and use as well as the short culture period could lead to a new approach in the treatment of burn and chronic wounds.     

表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面

目的探讨表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性和方法。方法分离培养SD大鼠皮肤表皮干细胞(ESCs),并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,随机分为A、B、C 3组,A组创面移植羊膜负载BrdU标记的ESCs组织工程皮肤;B组创面移植羊膜;C组为空白对照组,创面未给予干预。观察创面愈合情况、计算创面愈合率,HE及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分光密度平均值。结果与B、C组比较,A组创面愈合速度加快,创面愈合率明显增高,组间比较差异有显著性统计学意义(P0.01)。A组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,B、C组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见PCNA阳性细胞表达,但A组的阳性细胞积分光密度值与B、C组比较差异显著(P0.01)。结论表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤可有效促进糖尿病创面愈合。     

Morphological and distribution characteristics of sweat glands in hypertrophic scar and their possible effects on sweat gland regeneration

Background In hypertrophic scar tissue, no sweet gland and hair follicle exist usually because of the dermal and epidermal damage in extensive thermal skin injury, thus imparing regulation of body temperature. This study was designed to reveal the morphological and distributional characteristics of the sweat glands in normal skin and hypertrophic sear obtained from children and adults, and to study the possible interfering effects of the sear on regeneration of the sweat gland after burn injury.Methods Biopsies of hypertrophic sear were taken from four children (4 - 10 years) and four adults (35 -51 years). Normal, uninjured full-thickness skin adjacent to the sear of each patient was used as control. Keratin 19 (K19) was used as the marker for epidermal stem cells and secretory portion of the sweat glands, and keratin 14 (K14) for the tube portion, respectively. Immunohistochemical and histological evaluations were performed.Results Histological and immunohistoehemical staining of skin tissue sections from both the children and adults showed K19 positive cells in the basement membrane of epidermis of normal skin. These cells were seen only single layer and arranged regularly. The secretory or duet portion of the eccrine sweat glands was situated inthe dermis and epidermal layer. However, in the sear tissue, K19 positive cells were scant in the basal layer,and the anatomic location of the secretory portion of sweat glands changed. They were located between the border of the sear and reticular layer of the dermis. These secretory portions of sweat glands were expanded and were organized irregularly. But a few K14 positive cells were scattered in the sear tissues in cyclic form.Conclusions There are some residual sweat glands in sear tissues, in which the regeneration process of active sweat glands is present. Possibly the sweat glands could regenerate from adult epidermal stem cells or residual sweat glands in the wound bed after burn injury.     

偏光显微镜在组织工程血管构建中的应用

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11周时分别取材,普通光镜(HE和Masson染色)及偏光显微镜下观察组织学形态,并比较结果。以无细胞单纯管状PGA-DMEM植入裸鼠背部皮下作为对照。结果偏光显微镜下,随着植入时间的延长,实验组的PGA-平滑肌细胞复合结构从以PGA为主向以胶原和平滑肌细胞为主要成分过渡;对照组则随着PGA的降解无胶原成分形成。偏光显微镜检测结果与光镜下的组织形态学检查结果相同。结论偏光显微镜可用于组织工程血管壁中胶原成分的检测,方法简便且结果可靠。     

组织工程皮肤种子细胞生物学特性的研究

目的建立一种分离培齐组织工程皮肤种子细胞的方法,并对细胞的生物学特性进行研究。方法分别通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法对表皮干细胞和成纤维细胞进行分离培养,利用倒置相差显微镜和扫描电镜等对其进行形态学观察,MTT比色法对细胞的增殖动态进行测定,免疫组化法对两种细胞进行鉴定。结果分离的表皮细胞和成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖,活力较好,免疫组织化学染色为阳性。结论通过Dispase-胰蛋白酶消化法和组织块法分别获得的表皮干细胞和成纤维细胞在体外能够快速扩增、培养,可为下一步组织工程皮肤的构建提供充足、可靠的细胞源。     

胚胎皮肤细胞裸鼠皮下移植构建毛发发育模型

目的 观察胚胎皮肤细胞裸鼠皮下移植后的毛发发育情况,构建毛发发育模型.方法 从C57BL/6鼠胚胎的皮肤中分离出真皮和表皮细胞,将它们按照一定比例重新混合后采用注射法移植到裸鼠皮下,显微镜下观察毛发形成情况.结果 镜下观察到裸鼠皮下有毛囊及毛发纤维形成并有毛干长出.结论 胚胎皮肤细胞体内移植可以构建毛发发育的完整模型.

Abstract：

Objective To observe the hair development after subcutaneous implantation of embryonic skin cells in nude mice, and construct a model of hair development. Methods Dermal and epidermal cells isolated from embryonic mouse skin were mixed at a given ratio and injected subcutaneously in nude mice, and hair formation after the implantation was observed under a microscope. Results Formation of the hair follicles and fibers under the skin of the recipient nude mice and emergence of the hair shaft were observed microscopically. Conclusion Embryonic skin cells be used to construct a complete model of hair development after implantation in vivo.     

自体皮肤组织培养的实验研究

本研究应用不同来源皮肤组织进行表皮细胞培养获得成功，其结果证明：应用组织块培养成功率高，接种后２４小时后细胞开始生长，２－３周表皮细胞融合连片，表皮细胞层达５－６层，可用于临床，同时还发现，应用胶原做底层，表皮细胞生长快，融合连片快，在表皮细胞生长的同时成纤维细胞也生长，且生长速度快，阻碍表皮细胞的生长，用０．２５％胰蛋白酶与０．１％ＥＤＴＡ２：１混合液去除成纤维细胞效果较好，是细胞培养获得成功的