E血清型沙眼衣原体抗体的制备及检测

目的:制备高效价E血清型沙眼衣原体(CT)的多克隆抗体.方法:用hep-2细胞培养制备并用超速离心方法纯化E血清型CT作为抗原,采用弗氏佐剂乳化抗原,背部皮下多点免疫4只家兔,收获免疫后血清制备多克隆抗体,用Western blot方法进行鉴定,ELISA法检测抗体水平.结果:所有家兔在全程免疫后都产生了高效价的血清抗体,最高滴度达1∶1600.Western blot实验结果显示,本研究制备的CT血清抗体能与CT全菌体抗原发生b异结合.结论:CT菌体抗原免疫家兔可成功制备高效价的血清抗体,为建立沙眼衣原体免疫检测方法打下了基础.     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的：制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯（TPA）刺激的BCBL‐1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL‐1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21 kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经T PA刺激的BCBL‐1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。     

抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体细胞系的建立及鉴定

目的 初步建立抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体规模化制备技术平台,为制备抗人细胞色素P450(CYP450)亚型蛋白的单克隆抗体奠定基础.方法 按常规方法进行细胞融合,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选杂交瘤,以ELISA、免疫组化(HI)、免疫印迹(Western Blot)、免疫沉淀(IP)对单克隆抗体加以鉴定.结果 进行6次融合,共筛出216株杂交瘤,其分泌抗体类型为IgG1、IgG2a、IgG2b、及IgM.免疫组化(IH)图片上,人肝细胞浆内均可见阳性颗粒.免疫沉淀(IP)和免疫印迹(Western Blot)结果显示,所制备抗体与人肝微粒体蛋白有特异性结合.结论 筛选制备的单克隆抗体杂交瘤能分泌抗人肝微粒体蛋白单克隆抗体,并且有较强特异性,为下一步研究提供了基础与技术平台.     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体的制备与鉴定

目的制备兔抗人心肌肌钙蛋白I抗体并进行鉴定。方法用人工合成的cTnI蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果此次获得的抗血清 ELISA方法检测抗体滴度达到了1:16 000,检测cTnI的灵敏度最低为10μg/L。Western blot检测表明该抗体可有效识别原核细胞表达及大鼠心脏组织提取物中存在的cTnI蛋白。结论应用该方法成功制备了人cTnI的多克隆抗体,为进一步研究cTnI的结构与功能打下基础,并为有效制备高特异性的单克隆抗体提供借鉴。     

肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体。方法将我室保种的重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感受态BL21(DE3),IPTG诱导表达His-rhMCP融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化后,免疫家兔制备抗体,间接ELISA法测定抗体效价,以制备的菌体外膜蛋白(肝螺杆菌、胆型螺杆菌及幽门螺杆菌)采用Western blot鉴定抗体的特异性。结果大肠杆菌成功表达His-rhMCP融合蛋白,ELISA法检测抗体的效价达到1∶32000,Western blot检测结果显示抗体可与肝螺杆菌菌体外膜蛋白及His-rhMCP特异结合。结论制备了高效价、高特异性的rhMCP抗体,为进一步研究肝螺杆菌的流行病学奠定了基础。     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶多克隆抗体的制备

目的：制备兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NRDR）多克隆抗体。方法：应用原核表达的兔NRDR免疫豚鼠,制备豚鼠抗兔NRDR多克隆抗体,并以Western blot法分析抗体特异性。结果：免疫豚鼠获得了高效价抗血清,效价为1：2000时检测极限为160rig蛋白,与NRDR蛋白能特异性结合。结论：获得的多克隆抗体应用于Western blot中检测兔NRDR效果良好。为NRDR的进一步研究打下基础。     

血吸虫极低密度脂连结蛋白的表达及免疫原性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达日本血吸虫特异性极低密度脂连结蛋白(SVLBP)，纯化并鉴定其免疫活性。方法：SVLBP基因克隆菌在IPTG诱导下大肠杆菌中以6个组氨酸融合蛋白形式大量表达；非变性条件下制备克隆菌裂解液，离心后上演液经凝胶亲和层析纯化重组蛋白，已纯化的重组SSVLBP免疫家兔制备特异性抗血清，用SDS—PAGE和Western blot鉴定其免疫活性。结果：克隆菌在IPIG诱导下能大量表达重组蛋白SVLBP；重组SSVLBP蛋白能诱导家兔产生单特异抗体，琼脂双扩散法测抗体滴度＞1：16；表达产物能与血吸虫病人血清反应；单特异抗血清能识别天然成虫可溶性膜抗原的单一蛋白。结论：SVLBP能在克隆菌中大量表达并且具有较好的免疫原性。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157:H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86(0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157:H7EspF蛋白的抗血清效价达1:2048000;该血清对EHECO157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157:H7EspF蛋白多克隆抗体。     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

人肝脏微粒体多克隆抗体的制备

目的 利用肝脏微粒体制备多克隆抗体,为制备肝微粒体单克隆抗体奠定基础。方法 用肝微粒体制备抗原,免疫动物制备抗体,并用免疫沉淀、固相免疫吸附、Westem blotting法鉴定抗体特性。结果 在动物血清中检测到多克隆抗体。结论 鉴定肝微粒体多克隆抗体为将来制备肝微粒体单克隆抗体做前期工作。     

小鼠组蛋白去乙酰化酶2多肽抗血清的制备

目的利用人工合成小鼠组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)多肽制备特异性抗HDAC2抗血清,用于相关疾病的体内外诊断。方法根据HDAC2基因编码的氨基酸序列合成多肽,与载体偶联后免疫动物,所制备的抗血清用ELISA、Western blot及免疫组织化学方法鉴定。结果 ELISA检测表明所制备的抗血清可同多肽抗原发生阳性反应,效价1∶4 000;Western blot结果显示抗血清可与多肽抗原及APP/PS1转基因小鼠的脑组织发生反应;免疫血清1∶100,1∶200,1∶400,1∶800四个稀释度均能与小鼠脑组织中的HDAC2反应。结论所制备的多肽抗血清可识别组织及血清中的HDAC2,可应用于相关领域的体内外研究。     

抗GSTAl单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备鼠抗人谷胱甘肽S转移酶A1(GSTAI)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用纯化后的GSTAl融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备抗GSTAl的单克隆抗体(mAb)。用ELISA法测定鼠抗人GSTA1血清的效价;用Western blot方法鉴定抗血清的特异性。结果:筛选到l株可稳定分泌抗人GSTAlmAb的细胞株。腹水效价为12 800。Western blot显示在相对分子量(Mr)约25KD处出现特异性条带。说明制备的mAb可特异地识别成人肝细胞中相对分子量(Mr)约25KD的GST-GSTA1。结论:获得一株能特异性识别抗人GSTAI的单克隆抗体,可用于肝损伤性疾病的诊断。     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

Preparation and Characterization of Polyclonal Antibodies against VLDL Receptor

Verylowdensitylipoproteinreceptor (VLDL R)belongstothelowdensitylipoproteinreceptor(LDL R)superfamily .ItmaybindsthelipoproteinsandlipoproteinlipasescontainingapoE ,participatinginthemetabolismoftriglyceride richlipoproteins,whichplayanimportantroleinpath…