吗啡依赖和戒断小鼠海马MT1、MT2基因表达的变化

【目的】探讨吗啡依赖和戒断小鼠海马金属硫蛋白（metallothionein，MT）MT1、MT2 mRNA表达的变化。【方法】剂量递增法皮下注射吗啡建立吗啡依赖小鼠模型，腹腔注射盐酸纳络酮诱发戒断症状。根据小鼠戒断反应中出现的跳跃次数、体重下降等指标评定戒断反应的强度。采用半定量逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法，观察实验小鼠海马MT1、MT2 mRNA的变化情况。【结果】吗啡依赖组MT1、MT2 mRNA表达水平高于对照组和吗啡戒断组（P〈0．05），吗啡戒断组MT1、MT2 mRNA表达水平高于对照组（P〈0．05）。【结论】吗啡依赖小鼠海马MT1、MT2 mRNA表达增加，纳络酮戒断能够抑制吗啡依赖引起的MT1、MT2表达增加，表明海马MT的表达变化参与了吗啡依赖和戒断过程。     

核酶切割per基因所致的缓解吗啡成瘾作用研究

目的：探讨per基因与阿片类成瘾的相关性，进而寻找治疗阿片成瘾的基因戒毒疗法。方法：设计并合成特异性per锤头状核酶基因和per核酶靶mRNA组分基因，并分别重组人体外转录质粒，而后将经体外转录反应得到per核酶RNA和地高辛标记的per核酶靶mRNA组分。将转录产物混合，在不同条件下进行体外切割反应后，采用地高辛化学发光法检测per核酶的体外切割效率。小鼠脑室注射直接导入脂质体包裹的重组质粒pcDNA 3.1-per RZ DNA，按剂量递增法建立吗啡依赖动物模型，用纳洛酮催瘾，观察戒断反应的变化。结果：per核酶对per核酶靶mRNA组分的体外切割效率达到60％。重组质粒组小鼠的刻板跳跃、“湿狗”样抖动和打洞次数与空质粒组、生理盐水组相比明显减少，但并不抑制小鼠的体重下降。结论：per核酶具有体外定点切割per基因mRNA组分的活性。经小鼠吗啡成瘾模型检测，该重组质粒能成功转染活体小鼠脑细胞并在脑组织内稳定表达per核酶，发挥阻断per基因表达的作用，有效地减轻吗啡成瘾的戒断症状。     

N-硝基-L-精氨酸对吗啡、二氢埃托啡精神依赖性的逆转作用

目的：利用自行建立的条件性位置偏爱模型,探讨Ｎ－硝基－Ｌ－精氨酸（ＮＯ２Ａｒｇ）对阿片类物质诱导的精神依赖性的影响。方法：通过观察吗啡、二氢埃托啡精神依赖的昆明种小鼠,在皮下注射ＮＯ２Ａｒｇ前后于条件性位置偏爱箱偏爱侧停留的时间,判断小鼠精神依赖情况。结果：４ｍｇ／ｋｇＮＯ２Ａｒｇ使吗啡和二氢埃托啡精神依赖小鼠在偏爱侧停留时间分别由给予ＮＯ２Ａｒｇ前的（６．０９±２．０２）,（７．９８±０．７２）     

二陈汤对吗啡依赖小鼠位置偏爱效应的影响

目的：探讨二陈汤对吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱（CPP）的影响。方法：连续给予小鼠吗啡（9 mg/kg,sc,7 d）,使小鼠产生显著的条件性位置偏爱效应。将小鼠随机分为正常对照组、吗啡组、二陈汤低剂量、中剂量、高剂量五组,正常对照组注射等体积生理盐水,吗啡组注射吗啡,二陈汤组注射吗啡,同时给予三种不同剂量的二陈汤灌胃,并且检测对小鼠的奖赏效应或厌恶效应。结果：吗啡组小鼠在伴药箱中停留的时间明显延长,二陈汤可抑制吗啡引起的小鼠位置偏爱的形成。结论：二陈汤能在一定程度上抑制吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱效应。     

褪黑素减弱小鼠对吗啡的精神和身体依赖性

目的：观察褪黑素（ｍ ｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＴ）对吗啡依赖小鼠精神依赖性和身体依赖性的抑制作用。方法：用小鼠条件性位置偏爱（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｐｌａｃｅ ｐｒｅｆｅｒｅｃｅ，ＣＰＰ）模型及吗啡身体依赖进行观察。结果：单纯ＭＴ组小鼠在偏爱侧（黑箱）的停留时间给药前后差异无显著性。与吗啡同时ｉｐ ＭＴ１０ ｍ ｇ／ｋｇ ５ ｄ，显示出抑制吗啡精神依赖性反应的作用（Ｐ＜ ０．０１）。单次ｉｐ 给药，ＭＴ１０和２０ ｍ ｇ／ｋｇ，或连续与吗啡一同给予ＭＴ １０和２０ ｍ ｇ／ｋｇ，可剂量依赖地减少小鼠的跳跃次数（Ｐ＜ ０．０５）。结论：在一定的剂量范围内，ＭＴ具有抗小鼠对吗啡精神依赖和身体依赖的作用，且本身未显示精神依赖性反应。     

东莨菪碱对SD大鼠吗啡位置偏爱的影响

目的：通过观测东莨菪碱对雄性SD大鼠吗啡位置偏爱（相当于渴求）形成过程的影响,以期揭示胆碱能M型受体参与吗啡精神依赖的形成。方法：将24只无自然地点偏爱的雄性SD大鼠采用同窝异体配对设计随机分为实验组与对照组,均在建立吗啡依赖模型的过程中（10天）及戒断后（共14天）进行8次吗啡位置偏爱实验,比较两组大鼠在吗啡侧的停留时间,其中实验组于注射吗啡时加注东莨菪碱。结果：在吗啡依赖形成及戒断过程中,实验组（吗啡＋东莨菪碱组）和对照组（吗啡＋生理盐水组）在吗啡侧的停留时间均长于生理盐水侧,产生了对吗啡的位置偏爱,但两组相比实验组大鼠在吗啡侧的停留时间显著短于对照组（P＜0．05）,结论：东莨菪碱明显抑制了大鼠吗啡位置偏好的形成,揭示了乙酰胆碱M型受体参与了吗啡的精神依赖。     

脱氧核酶对cip1/waf1 mRNA的切割及对人绒毛膜癌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的探讨脱氧核酶对cip1/waf1 mRNA的切割作用及对人绒毛膜癌细胞凋亡相关基因表达的影响.方法针对cip1/waf1基因的核苷酸序列,合成"10～23"型脱氧核酶及其类似物,提取总RNA在体外切割cip1/waf1 mRNA;转染绒毛膜癌细胞后,用RT-PCR扩增和荧光免疫方法测定cip1/waf1和凋亡相关基因bcl-2和bax的表达.结果未经修饰的脱氧核酶DzT和在DzT的3′末段添加倒位连接T碱基的脱氧核酶DzTi在体外能够有效地切割cip1/waf1 mRNA;在转染绒毛膜癌细胞后,DzTi比DzT对cip1/waf1 mRNA表现出更强的切割作用,能显著地降低细胞内cip1/waf1蛋白(p21cip1/waf1蛋白或p21蛋白)水平(P＜0.01),下调bax基因的表达(P＜0.05),但对bcl-2基因的表达和细胞的生长未表现出显著的影响(P＞0.05).DzT和DzTi的催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸DzT′和DzTi′在胞外和胞内均不表现对cip1/waf1 mRNA的切割作用.结论人工合成的脱氧核酶确实能够高效特异地切割cip1/waf1 mRNA,并能上调凋亡促进基因bax的表达,表明脱氧核酶确实能够通过切割cip1/waf1 mRNA来参与细胞的凋亡过程.     

吗啡依赖和戒断大鼠行为及垂体阿黑皮源基因表达

目的：结合行为学观察从分子水平上研究吗啡依赖和戒断机理及丁丙诺啡对吗啡戒断的影响。方法：观察吗啡戒断大鼠的戒断体征及条件性位置偏爱情况;利用核酸分子杂交技术研究其垂体阿黑皮源（POMC）基因表达的变化。结果：停用吗啡后,大鼠条件性位置偏爱的消失迟于戒断体征,吗啡依赖及戒断时垂体POMCmRNA含量下降。结论：垂体POMC基因表达的改变可以是精神依赖产生的生理基础之一。     

10-23脱氧核酶沉默Survivin基因表达诱导人肝癌细胞的凋亡的研究

目的 研究脱氧核酶沉默 Survivin表达对人肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响。方法 合成针对Survivin基因的"10～23"型脱氧核酶及其类似物;转染肝癌细胞;RT-PCR检测脱氧核酶细胞内Survivin mRNA的切割作用; 荧光免疫法测定脱氧核酶对Survivin蛋白表达影响;流式细胞术检测脱氧核酶对肝癌细胞凋亡的影响。结果 "10～23"型脱氧核酶及其类似物成功转染入肝癌;非修饰脱氧核酶（DzT）和修饰的脱氧核酶（DzTi）能有效抑制肝癌细胞的生长 (P<0.05);DzT和DzTi在胞内能有效地切割Survivin mRNA,DzTi比DzT的切割活性更显著;荧光免疫法测的DzT和DzTi能显著的下调Survivin蛋白水平(P<0.01);流式细胞术结果提示,DzT和DzTi细胞凋亡率明显升高出现凋亡峰（P＜0.05）;DzT和DzTi组细胞出现细胞周期阻滞, 表现为G0/G1 细胞所占比例上升,S期细胞所占比例下降。结论 脱氧核酶能有效沉默Survivin mRNA表达,抑制Survivin蛋白表达和促进肝癌细胞凋亡。     

东莨菪碱、黄芪合用对小鼠吗啡精神依赖性的影响

目的观察东莨菪碱、黄芪合用对吗啡依赖小鼠精神依赖性的影响。方法昆明种小鼠30只,按分层随机区组设计分为3组：东莨菪碱组（D组）、黄芪组（H组）、东莨菪碱＋黄芪组（DH组）。前3天上午小鼠皮下注射吗啡后立即放入偏爱器的白室30min,下午按分组分别皮下注射东莨菪碱、黄芪、东莨菪碱＋黄芪30min后放入黑室30min,第4天将小鼠放人偏爱器中,记录15min内小鼠在白室的停留时间。结果DH组在白室停留时间明显短于D组和H组（P〈0．05）。结论东莨菪碱和黄芪合用较分别单用对小鼠条件性位置偏爱形成的抑制作用更显著,即二者合用对抑制小鼠吗啡精神依赖性的形成有协同作用。     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体，探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1，并将其转染NIH3T3细胞，采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达，检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA，细胞中的活性氧水平明显升高，同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1，使活性氧水平升高，并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

icl mRNA特异性10-23DRz在小鼠体内抗结核分枝杆菌感染的实验研究

目的探讨iclmRNA特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在小鼠体内感染的影响,及其单独或与异烟肼(isoniazidum,INH)联合应用治疗小鼠结核病的效果。方法分别用DZ4、INH、INH+DZ4-S或INH+DZ4对Mtb进行预处理,再用上述经过预处理的Mtb感染BALB/c小鼠,一定时间后进行小鼠肺组织Mtb培养及病理学改变观察。利用DZ4-FITC溶液对BALB/c小鼠进行滴鼻处理,检测滴鼻途径给药的效果。采用尾静脉注射法建立小鼠结核病模型,将模型小鼠随机分为5组(n=10),分别给予生理盐水、DZ4、INH、INH+DZ4、INH+DZ4-polyG治疗,于治疗完成2周后进行小鼠肺组织Mtb荷菌量检测和病理学改变观察。结果Mtb感染后2周,各组小鼠的肺组织荷菌量均无显著性差异(P>0.05)。感染进行至4～12周时,INH+DZ4预处理组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量较其它各组均显著偏低(P<0.05),肺组织的病理改变较其他各组也明显轻微。经滴鼻途径给予DZ4-FITC溶液4h后,小鼠肺组织冰...     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.