Wnt/β-catenin信号传导途径在肺癌细胞A549中的作用

目的 研究Wnt/β-catenin信号传导途径在肺腺癌细胞系A549中的激活及其作用.方法 用不同浓度的GSK-3β抑制剂Licl作用A549细胞,采用免疫组化法对β-catnin的细胞内表达定位,采用MTT细胞增殖实验观察细胞增殖活性,用克隆形成实验观察克隆形成能力,用Western blot检测β-catenin和干细胞分子标志OCT-4的表达.结果 10mmol/L Licl作用24h,A549细胞中的β-catenin表达增加并出现核转移,同时增殖能力与克隆形成能力增强,干细胞标记蛋白OCT-4的表达增加.结论 Wnt/β-catenin信号通路在维持A549细胞增殖和克隆形成能力及增强OCT-4的表达方面有着重要作用,可为肺癌治疗提供新的靶点.     

高浓度葡萄糖对小鼠表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对小鼠表皮干细胞增殖的影响.方法 利用Ⅳ型胶原的快速黏附法分离培养小鼠表皮干细胞,观察其形态学;通过免疫荧光法检测表皮干细胞标志物β1整合素和K19来鉴定表皮干细胞;将小鼠表皮干细胞分别放在葡萄糖浓度为5.6、15和30mmol/L的培养基里培养;MTT法检测细胞增殖情况,免疫印迹法检测细胞凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平.结果 体外培养的小鼠表皮干细胞呈克隆样生长,增殖速度较快,细胞形态呈铺路石样,边缘细胞呈梭形,细胞核质比较大;免疫荧光法检测到培养的小鼠表皮干细胞β1整合素和K19呈阳性表达且阳性表达率均为100％;MTT法检测到与对照组（5.6mmol/L浓度葡萄糖）相比,15mmol/L浓度葡萄糖刺激72h后检测到细胞增殖速度无明显改变,而30mmol/L浓度葡萄糖刺激24、48和72h后检测到细胞增殖速度降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blot法检测到与对照组相比,30mmol/L浓度葡萄糖刺激48h后凋亡蛋白Bax的蛋白表达量明显增加而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）.结论 本研究结果表明较高浓度（30mmol/L）葡萄糖可以明显抑制小鼠表皮干细胞的增殖,从干细胞角度进一步为糖尿病创面难愈的原因提供了实验室依据.     

HepaCAM基因对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用研究

目的:研究hepaCAM基因对人膀胱癌T24细胞增殖的影响.方法:运用脂质体转染方法,将pEGFP-N2-hepaCAM质粒转入T24细胞株,经G418筛选获得稳定表达的细胞株;RT-PCR及Western blot方法检测目的基因和蛋白表达;MTT法及克隆形成实验研究hepaCAM基因对T24细胞体外生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR技术测定周期调控蛋白CyclinD1的mRNA表达变化.结果:RT-PCR和Western blot方法分别检测到hepaCAM的基因表达和蛋白表达,MTT检测转染hepaCAM基因的细胞生长速度较对照组和空载体组明显减慢(P<0.01),克隆形成率明显小于对照组和空载体组(P<0.01).细胞周期中G0/G1期比例明显增高(P<0.05),而S期比例减少;CyclinD1 mRNA表达明显下调(P<0.05).结论:HepaCAM基因通过阻滞细胞于G0/G1期,减少CyclinD1 mRNA表达,抑制T24细胞的增殖.     

外源性Wnt-3a促进急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与细胞周期进展

目的 应用重组腺病毒介导的Wnt-3a激活急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中的经典Wnt/β-catenin信号途径,观察该途径激活后对Jurkat细胞增殖及细胞周期的影响,初步探讨其在急性T淋巴细胞白血病分子发病机制中的作用.方法 将携带Wnt-3a基因的重组腺病毒(Ad5-Wnt-3a)感染Jurkat细胞,实验分为3组:实验组(Jurkat/Ad5-Wnt-3a)、空载体组(Jurkat/Ad5-GFP)和空白对照组(Jurkat).转染后,采用RT-PCR方法检测Jurkat细胞内Wnt-3a mRNA的表达;Western blot检测细胞内β-catenin蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞周期,RT-PCR检测Wnt信号通路下游靶基因c-myc和cyclin D1 mRNA表达.结果 重组腺病毒Ad5-Wnt-3a转染Jurkat细胞后48 h,实验组有效表达Wnt-3a的基因.Western blot结果显示,与对照组比较,实验组细胞内β-catenin蛋白表达明显增加(P<0.05).MTT结果显示,Wnt-3a转染后48 h和72 h可明显促进Jurkat细胞的增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).FCM检测发现,Wnt-3a转染后可引起细胞G0/G1期下降,S期升高(P<0.05).RT-PCR检测结果显示细胞内c-myc和cyclin D1 mRNA表达升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 腺病毒介导的Wnt-3a可以激活Jurkat细胞中的经典Wnt/β-catenin信号途径,使Jurkat细胞增殖,促进细胞周期进展,其可能的机制是通过调控其下游靶基因c-myc和cyclin D1的表达实现.     

细胞粘附分子-1抑制膀胱癌细胞侵袭转移的机制研究

目的：探讨细胞粘附分子-1(cell adhesion molecule-1,CADM1）过表达和干扰前后对人膀胱癌T24细胞恶性行为的影响及其机制。方法：利用前期构建的Ad-CADM1-T24、Ad-GFP1-T24、Ad-sh1-T24、Ad-GFP2-T24稳转细胞株,以T24细胞作为对照,Western blot检测细胞周期相关蛋白p27、cyclinD1、cyclinE1、CDK2,上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transi－tion,EMT）相关蛋白E-cadherin、β-catenin、Vimentin,凋亡相关蛋白caspase-3、bcl-2、bax的表达情况;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果：Western blot结果显示Ad-CADM1-T24细胞与其他细胞相比,凋亡相关蛋白caspase-3、bax表达量升高,bcl-2表达量降低;细胞周期相关蛋白p27表达量明显上调,cyclinD1、CDK2、cyclinE1表达量明显下调;EMT相关蛋白E-cadherin、β-catenin表达量明显上调,Vimentin表达量明显下调;MTT结果显示Ad-CADM1-T24细胞与其他细胞相比,细胞增殖明显受到抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell侵袭实验结果显示,Ad-CADM1-T24细胞与其他细胞相比,24 h细胞穿膜数量明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：CADM1过表达可明显抑制膀胱癌细胞的侵袭转移,其机制可能与抑制细胞增殖和EMT及促进细胞凋亡有关。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 观察Livin基因对于膀胱癌细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcD-NA3.1(+).应用蛋白印迹(Western blo)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法来检测Livin在转染细胞中的表达;应用克隆形成试验检测细胞增殖活性.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin*及T24/pcDNA3.1(+).Western blot及KT-PCR法检测结果表明Livin在T24/livin+中表达阳性.而在T24与T24/pcDNA3.1(+)中表达阴性,Livin的袁达导致了膀胱癌细胞系更强的细胞增殖能力(P=8.41×10-s,P＜0.01).结论 Livin基因在膀胱癌T24细胞系中诱导细胞增殖,其表达与膀胱癌的发生、发展有关.     

S-腺苷甲硫氨酸通过hepaCAM抑制膀胱癌细胞增殖迁移

目的：探究S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）通过hepaCAM对膀胱癌（bladder cancer,BCa）细胞增殖和迁移的影响及其可能的分子机制。方法：不同浓度SAM作用于体外培养的T24和BIU细胞,四甲基偶氮唑盐（3-（4,5-dimethylth－iazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）法检测SAM对细胞增殖的影响。用不同浓度的SAM（0、0.8、1.6 mmol/L）处理T24和BIU细胞72 h后,Real-time PCR和Western blot法检测甲基结合蛋白-2（methyl DNA-binding domain protein,MBD2）、组蛋白去乙酰化酶-1（histone deacetylases,HDAC1）以及肝细胞黏附分子（hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM）的表达;划痕及Transwell实验检测各组细胞的迁移能力;克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力。结果：SAM抑制T24和BIU细胞生长且与药物浓度和作用时间呈正相关。与0 mmol/L组相比,0.8 mmol/L的SAM处理T24和BIU细胞72 h后MBD2 mRNA表达明显降低（P=0.048;P=0.038）,蛋白表达明显降低（P=0.001;P=0.000）;0.8 mmol/L的SAM处理T24细胞72 h后HDAC1 mRNA和蛋白水平明显降低（P=0.000;P=0.001）;0.8 mmol/L的SAM处理BIU细胞72 h后HDAC1 mRNA水平无统计学差异（P=0.140）,蛋白表达明显降低（P=0.004）;0.8 mmol/L的SAM处理T24和BIU细胞72 h后hepaCAM mRNA水平明显增加（P=0.003;P=0.008）,蛋白表达无统计学差异（P=0.770;P=0.381）;1.6 mmol/L的SAM处理T24和BIU细胞72 h后MBD2 mRNA水平明显降低（P=0.003;P=0.000）,蛋白表达明显降低（P=0.001;P=0.000）;HDAC1 mRNA水平明显降低（均P=0.000）,蛋白表达明显降低（P=0.001;P=0.000）;hepaCAM mRNA和蛋白表达均明显增加（均P=0.000）。划痕及Transwell实验结果显示SAM处理T24和BIU细胞72 h后迁移能力受到明显抑制（P<0.05）。克隆形成实验结果显示SAM处理T24和BIU细胞72 h后细胞克隆形成能力明显降低（P<0.05）。结论：SAM可通过MBD2/HDAC1逆转hepaCAM的表达,抑制BCa细胞的增殖及迁移能力。     

益气解毒方通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响

目的探讨益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法将CNE2细胞用不同浓度(0.25、0.50、1.0 g/L)的益气解毒方水提物和阳性对照药(顺铂,4 mg/L)分别处理24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测药物作用48 h后细胞周期分布情况;Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt5a/b、β-catenin及细胞周期蛋白CyclinD1的表达情况。结果MTT结果显示,益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞增殖具有明显抑制作用,且其抑制作用与作用时间、药物浓度呈正相关(P<0.05)。细胞周期结果显示,处理48 h后,G0/G1期比例降低,S期和G2/M期比例增加(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,水提物处理48 h后,Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt5a/b、β-catenin及细胞周期蛋白CyclinD1的表达量明显下降(P<0.01)。结论益气解毒方可通过下调Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt5a/b、β-catenin及细胞周期蛋白CyclinD1的表达,阻滞细胞周期,抑制人鼻咽癌CNE2细胞的增殖。     

丹参酮IIA对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡和细胞周期蛋白B1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的探讨丹参酮IIA(TanIIA)对膀胱癌T24细胞株体外增殖、凋亡以及细胞周期蛋白B1(CyclinB1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3信使核糖核酸(Caspase-3 mRNA)表达的影响。方法体外培养T24细胞,分别给予不同浓度(5 mg/L和10 mg/L)TanIIA,MTT法检测细胞增殖能力,AnnexinV/PI检测细胞凋亡,逆转录-聚合酶链式反应(RTPCR)检测细胞CyclinB1、Caspase-3 mRNA的表达。结果 MTT结果显示:5～10 mg/L TanIIA作用48 h均对T24细胞增殖有抑制作用,对细胞凋亡有诱导作用,而且CyclinB1mRNA下调及Caspase-3 mRNA上调,且均呈浓度依赖性。结论 TanIIA可能通过抑制CyclinB1mRNA和增加Caspase-3mRNA的表达水平,抑制膀胱癌T24细胞增殖及诱导凋亡,发挥抗膀胱癌的作用。     

吲哚美辛对K562细胞株BCR/ABL-Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨吲哚美辛对K562细胞增殖的影响及其分子机制。方法采用不同浓度的吲哚美辛作用于K562细胞,MTT法
检测其对细胞增殖的影响,克隆形成实验检测吲哚美辛对K562细胞克隆形成能力的影响。RT-PCR分别检测bcr-abl、β-catenin
的mRNA表达变化,Western blot分别检测pBCR/ABL、总BCR/ABL、β-catenin、pGSK-3β、c-myc的蛋白表达变化。结果100、
200、400 μmol/L吲哚美辛作用细胞48 h后,以浓度依赖性方式抑制K562细胞的增殖和克隆形成能力。3种浓度的吲哚美辛处
理K562细胞后,pBCR/ABL、总BCR/ABL的蛋白表达依次减少,而bcr-abl mRNA水平没有明显变化。β-catenin mRNA和蛋白
水平依次减少;pGSK-3β、c-myc 的蛋白水平均明显降低。结论吲哚美辛可通过抑制BCR/ABL-Wnt/β-catenin 信号通路的活
性,从而抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力。
     

硫氢化钠对高浓度葡萄糖环境下原代人脐静脉内皮细胞的影响

目的 观察硫氢化钠(NaHS,外源性的H2S供体)对高浓度葡萄糖环境下原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用。方法 以0.125%胰酶和0.01%EDTA灌注法获得HUVECs,分别用5.5mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖+50μmol/L NaHS及50μmol/L NaHS处理72h,采用MTT法检测各组细胞的存活率,Western blot法检测H2S生成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-Iyase,CSE)的变化。结果 MTT检测表明,25mmol/L葡萄糖组的HUVECs存活率比5.5mmol/L葡萄糖组下降28.37%(P<0.05),而50μmol/L NaHS和25mmol/L葡萄糖共同处理组的细胞存活率比25mmol/L葡萄糖组上升30.3%(P<0.05),50μmol/L NaHS组与5.5mmol/L葡萄糖组无明显差异(P>0.05)。与5.5mmol/L葡萄糖组相比,以25mmol/L葡萄糖处理72h后能使CSE蛋白的表达下降(P<0.05),而25mmol/L葡萄糖+50μmol/L NaHS 则能改善这种损害作用(P<0.05),CSE蛋白的表达比25mmol/L葡萄糖组增强。结论 高浓度葡萄糖降低人原代脐静脉内皮细胞的生长和存活率,减少CSE蛋白的表达,而NaHS能够减轻高浓度葡萄糖对CSE的作用。     

阻断胃泌素受体对胃癌细胞增殖和凋亡及其信号通路的影响

目的 探讨阻断胃泌素受体对胃癌细胞增殖、凋亡及其相关通路中关键蛋白表达的影响.方法 试验组使用终浓度为5mmol/L的丙谷胺(胃泌素受体阻断剂)处理胃癌细胞SGC-7901和AGS6d,以不加丙谷胺培养的胃癌细胞SGC-7901和AGS为对照组.四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测各组细胞的生长并绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,Annexin V-FITC/PI 双染法检测各组细胞的凋亡;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测典型Wnt/β-catenin通路、核因子κB、磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、核转录因子RelA、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、糖原合酶激酶3β mRNAs的表达;免疫蛋白印迹检测β-catenin蛋白质的表达.结果 用丙谷胺处理后,试验组细胞的生长速度低于对照组细胞,细胞周期中S期细胞百分数也低于对照组细胞,而G0/G1期细胞百分数高于对照组细胞(P<0.05);试验组的细胞凋亡数高于对照组(P<0.05); RT-qPCR结果显示:丙谷胺处理后,胃癌细胞中β-catenin的 mRNA表达量降低(P<0.05).Western blot结果显示丙谷胺处理后,β-catenin蛋白质的表达量降低(P<0.05).结论 阻断胃泌素受体能下调胃癌细胞中β-catenin的表达,抑制细胞增殖,同时促进细胞凋亡.     

三氧化二砷对膀胱癌T24细胞增殖及APC基因表达的影响

目的:探讨三氧化二砷（arsenic trioxide,As₂O₃）对人膀胱癌T24细胞增殖及腺瘤性结肠息肉病相关基因（adenomatous polyposis coli,APC）表达的影响。方法:采用2、4、8 μmol/L的As₂O₃处理T24细胞,MTT法检测T24细胞增殖抑制率;脱氧核糖核酸原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡;用RT-PCR及Western blot法分别检测As₂O₃对T24细胞中APC mRNA和蛋白表达的影响。结果:As₂O₃在2~8 μmol/L浓度范围内处理T24细胞72 h可有效抑制细胞增殖（P<0.01）;促进细胞凋亡（P<0.01）;增加APC mRNA和蛋白表达（P<0.01）。结论:在一定浓度范围内（2~8 μmol/L）As₂O₃可以有效抑制T24细胞增殖和诱导其凋亡,其机制可能与上调APC基因的表达有关。     

氯化锂对经血源性间充质干细胞增殖和神经分化的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)对经血源性间充质干细胞(MMCs)增殖和神经分化的影响。方法:CCK-8法检测不同浓度(0、4、10、20、40 mmol/L)Li Cl作用4 d对MMCs增殖的影响,采用半定量PCR和Western blot法检测4 mmol/L Li Cl对MMCs中β-catenin表达的影响;采用免疫细胞化学检测对照组、诱导分化组(DMSO和β-ME联合诱导分化)和4 mmol/L Li Cl诱导组细胞中NF和NSE阳性细胞率,采用半定量PCR检测NF和NSE在转录水平的表达。结果:低浓度(4、10 mmol/L)Li Cl促进MMCs增殖,高浓度(20、40 mmol/L)Li Cl抑制MMCs增殖。与对照组相比,4 mmol/L Li Cl处理可增加β-catenin蛋白的表达水平(t=64.500,P<0.001),而mRNA的表达水平无明显变化(t=1.606,P=0.183)。诱导分化组细胞中NF和NSE mRNA的表达水平及蛋白的阳性表达率升高(P<0.05);与诱导分化组相比,4 mmol/L Li Cl诱导组NF和NSE mRNA的表达水平及蛋白的阳性表达率降低(P<0.05)。结论:4 mmol/L Li Cl可通过增强β-catenin蛋白的表达激活Wnt/β-catenin信号通路,促进MMCs的增殖;而在诱导分化过程中,Li Cl通过抑制NF和NSE在转录和蛋白水平的表达抑制MMCs向神经元分化。     

基于Wnt/β-链蛋白信号通路观察高糖环境对大鼠下颌骨骨髓基质细胞增殖的影响

目的 观察高糖环境对大鼠下颌骨骨髓基质细胞增殖的影响,并结合Wnt/β-链蛋白信号通路初步探讨高糖对骨髓基质细胞增殖的影响。方法 从Wistar大鼠下颌骨中分离培养骨髓基质细胞,分别给予不同糖浓度(5.5和16.5 mmol/L)干预,采用噻唑蓝法观察骨髓基质细胞1、3、5、7 d时的增殖情况,采用流式细胞仪对高糖干预5 d细胞进行细胞周期检测,Western免疫印迹检测5 d时β-链蛋白和细胞周期蛋白D1的表达,实时定量多聚酶链反应检测淋巴增强因子-1和细胞周期蛋白D1的mRNA表达。结果 噻唑蓝法检测结果显示,1 d骨髓基质细胞在两种糖浓度中的光密度值差异无统计学意义(P=0.700),3、5、7 d时16.5 mmol/L组的细胞光密度值显著低于5.5 mmol/L组(P=0.006,P=0.002,P=0.003)。5 d的细胞周期结果显示,与5.5 mmol/L组细胞相比,16.5 mmol/L组细胞可以抑制细胞从G1期向S期转化,16.5 mmol/L组细胞的增殖指数显著低于5.5 mmol/L组(P=0.014)。与5.5 mmol/L组相比,16.5 mmol/L组细胞明显抑制β-链蛋白的表达,同时Wnt/β-链蛋白通路中淋巴增强因子-1 mRNA及下游细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白的表达也受到明显抑制。结论 高糖环境可以通过抑制Wnt/β-链蛋白信号通路中关键因子β-链蛋白、淋巴增强因子-1及下游与细胞增殖相关靶基因细胞周期蛋白D1的表达,进而抑制骨髓基质细胞的增殖。     

Smad4基因对胰腺癌细胞E-cadherin、β-catenin表达及增殖的影响

目的探讨Smad4基因对人胰腺癌细胞BxPC3 E-cadherin、β-catenin表达及细胞增殖的影响,为试图运用Smad4对胰腺癌进行基因治疗提供实验依据。方法经脂质体介导将含有Smad4重组表达质粒转染人胰腺癌细胞Bx-PC3,用G418筛选及RT-PCR、Western blot鉴定;分别采用RT-PCR和Western blot检测转染阳性细胞克隆E-cadherin、β-catenin表达改变;又分别采用噻唑盐（MTT）比色法及5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入法检测阳性细胞克隆的增殖活性。结果成功建立表达Smad4的阳性BxPC3克隆（S4-8,S4-23）,并证实其E-cadherin、β-catenin mRNA及蛋白表达均明显升高。MTT法和BrdU掺入法显示,S4-8与S4-23细胞克隆增殖显著降低。结论 Smad4可增加胰腺癌细胞E-cadherin及β-catenin的表达并抑制其增殖,Smad4可能对胰腺癌具有基因治疗的效果。     

依他尼酸联合顺铂化疗促肺癌A549细胞凋亡的作用及机制研究

目的 探讨依他尼酸(ethacrynic acid,EA)杀伤肺癌A549细胞球的作用及机制研究.方法 无血清培养基中培养A549细胞球,应用Western blot检测CD133、SOX2、EpCAM和ABCG2的蛋白表达水平.应用l、2、5、10、20 mg/mL的浓度顺铂(cisplatin,DDP)分别处理A549及细胞球48 h,用MTT检测48 h内细胞的存活率.应用比色法检测10、50、100、200 μmol/L EA对A549细胞球中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性的抑制作用.应用流式细胞术、Western blot、Real-time-PCR、相差显微镜观察检测200 μmol/L EA处理A549细胞球前后ROS水平、细胞成球能力、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白以及β-catenin启动子活性的变化情况.应用β-catenin腺病毒感染A549细胞球后,再用200 μmol/L EA的处理A549细胞球,利用Real-time PCR和Western blot检测β-catenin S、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的变化,并用MTT检测A549细胞球增殖的抑制作用.结果 成功培养出悬浮的A549细胞球,其高表达肿瘤干细胞标志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐药相关蛋白ABCG2,并可耐受不同浓度DDP的杀伤作用.200 μmol/L EA处理A549细胞球后ROS水平明显升高,而GST活性、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的表达、β-catenin的启动子活性、A549细胞球的成球能力显著下降,并且200 μmol/L EA联合5 mg/mL DDP可增强对抑制A549细胞球增殖的作用和增加细胞凋亡的水平(P＜0.05).过表达β-catenin后,200 μmol/L EA对β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用较空载体组显著减弱.此外,过表达β-catenin可显著缓解200 μmol/L EA联合5 mg/mLDDP对A549细胞球的增殖抑制作用.结论 EA通过抑制GST活性和β-catenin水平,发挥抑制A549细胞球增殖和干性,促进其凋亡的作用.EA可望成为治疗肺癌及肺癌干细胞的药物.     

慢病毒载体介导的RNAi技术构建稳定抑制β-catenin的人鼻咽癌细胞株

目的建立稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在鼻咽癌发生中的作用提供细胞模型。方法于β-catenin CTNNB1基因编码区选择3个siRNA靶点合成3对shRNA干扰序列,分别与pLKO.1载体连接,构建pLKO.1-sh-β-catenin质粒(干扰组1)、pLVTHM-sh-β-catenin(干扰组2)和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒(阴性对照组);将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集含慢病毒颗粒的上清液感染人鼻咽癌6-10B细胞,感染pLKO.1-sh-β-catenin和pLKO.1-sh-β-catenin-Neg质粒的细胞经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株。Western blot检测干扰组β-catenin抑制效率及下游基因c-myc蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测比较细胞增殖状况,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移率。结果 Western blot检测结果显示pLKO.1-sh-β-catenin(干扰组1)干扰效率最佳,β-catenin及c-myc蛋白表达减少;MTT检测显示干扰β-catenin后细胞吸光度下降,细胞增殖受到抑制;穿过Transwell小室底膜的细胞数:干扰组1为(23.5±4.6)个,明显低于阴性对照组(50.3±5.3,P<0.01)及空白对照组(54.3±5.6,P<0.01)。结论成功构建了β-catenin shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的人鼻咽癌6-10B细胞株,为进一步研究以β-catenin为靶点的鼻咽癌基因治疗奠定基础。     

不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP及PTH1R的表达影响研究

目的　探讨不同浓度葡萄糖对INS-1细胞PTHrP/PTH1R表达的影响以及对细胞增殖的作用。方法　根据不同干预条件分为无糖组,正常葡萄糖组（5mmol/L）组及高浓度葡萄糖（30mmol/L）组,培养96h应用MTT检测各组细胞活力,应用Westernblot及RT-PCR检测PTHrP/PTH1R蛋白及mRNA表达。结果　无糖组及高浓度葡萄糖组细胞活力比较正常葡萄糖组下降,高浓度葡萄糖组细胞活力低于无糖组,PTHrP和PTH1R蛋白或mRNA在高浓度葡萄糖组中表达显著下调。结论　表明不同浓度葡萄糖可以通过调控PTHrP/PTH1R的水平从而影响INS-1的增殖。     

hS100A6 inhibits proliferation, induces apoptosis and up-regulates Wnt/β-catenin activity in ovarian cancer cell lines HO8910 and HO8910 PM

目的 研究hS100A6(human S100A6)对人卵巢癌细胞系(低转移系HO8910和高转移系HO8910 PM)增殖、凋亡和Wnt/β-catenin信号途径的影响.方法 通过MTT以及台盼蓝染色检测细胞增殖的变化;Hoechst检测细胞凋亡的变化;提取细胞总蛋白及核蛋白Western blot检测hS100A6对β-catenin的影响.结果 MTT及台盼蓝染色结果显示hS100A6抑制HO8910细胞和HO8910 PM细胞的增殖(P＜0.05),Hoechst染色结果显示hS100A6同时促进这两系细胞的 凋亡(P＜0.05);Western blot显示hS100A6增加β-catenin的水平并促进其发生核转位.结论 hS100A6能抑制人卵巢癌细胞系HO8910和HO8910 PM增殖,促进其凋亡,同时激活Wnt/β-catenin信号途径.