Nurrl基因在大鼠体外培养骨髓基质细胞的表达

目的:为获得高效表达孤儿核受体(orphan nuclear receptor,Nurrl)基因的骨髓基质细胞.方法:采用分子克隆技术,构建携带Nurrl基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体;与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒phelper一起用磷酸钙法转染包装细胞HEK293制备具有感染活性的AAV-Nurrl病毒粒子;用病毒上清液感染原代培养的大鼠骨髓基质细胞(Marrow stromal cells,MSCs),并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞.结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组pAAV-Nurrl;感染HT1080细胞进行病毒滴度测定,每mL病毒贮存液可达1012个阳性细胞;获得了Nurrl阳性的骨髓基质细胞,阳性率在60%以上.结论:重组AAV携带的Nurrl基因能够在MSCs中表达,本文为进一步探讨将该细胞用于帕金森病基因治疗的可能性研究奠定了基础.     

Nurrl基因在大鼠体外培养骨髓基质细胞的表达

目的：为获得高效表达孤儿核受体(orphan nuclear receptor，Nurrl)基因的骨髓基质细胞。方法：采用分子克隆技术，构建携带Nurrl基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体；与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒phelper一起用磷酸钙法转染包装细胞HEK293制备具有感染活性的AAV-Nurrl病毒粒子；用病毒上清液感染原代培养的大鼠骨髓基质细胞(Marrow stromal cells，MSCs)，并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果：经酶切鉴定和DNA测序，得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1；感染HTl080细胞进行病毒滴度测定，每mL病毒贮存液可达10^12个阳性细胞；获得了Nurrl阳性的骨髓基质细胞，阳性率在60％以上。结论：重组AAV携带的Nurrl基因能够在MSCs中表达，本文为进一步探讨将该细胞用于帕金森病基因治疗的可能性研究奠定了基础。     

Nurr1基因在体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞的表达

目的获得表达孤儿核受体（Nurr1）基因的骨髓源性神经干细胞（BMSCs-NSCs）。方法构建携带Nurr1基因的重组腺相关病毒（AAV）载体AAV-pcDNA3．1-Nurr1，提取质粒，用脂质体转染法转染大鼠BMSCs-NSCs，并用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果经酶切鉴定和DNA测序，证实得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1，获得了Nurr1阳性的BMSCs-NSCs。结论重组AAV携带的Nurr1基因能够在BMSCs-NSCs中表达，本研究为进一步探讨将该基因工程细胞用于帕金森病基因治疗提供了可能性，     

Neurturin基因在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的构建携带一种神经营养因子Neurturin(NTN)基因的腺病毒(Ad),使其在骨髓基质细胞(BMSCs)中表达。方法采用分子克隆技术,构建携带NTN基因的Ad载体,用脂质体法转染、包装HEK293细胞,制备具有感染活性的Ad-NTN病毒粒子;用病毒上清液感染原代培养的大鼠BMSCs,并用免疫细胞化学方法检测阳性细胞。用W estern B lot检测转染Ad-NTN的BMSCs细胞上清液。结果经酶切鉴定和DNA测序,得到重组Ad-NTN,对被感染的HEK293细胞进行病毒滴度测定,每毫升病毒贮存液可达1×108.5半数组织培养感染量(TC ID50);将病毒贮存液感染BMSCs,获得了表达NTN的BMSCs,阳性率为65%。W estern B lot检测证实BMSCs上清液中出现特异性NTN条带。结论重组Ad携带的NTN基因能够在BMSCs中表达。     

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的　构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法　使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果　重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论　本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 ,用于基因治疗的研究     

NT-3基因过表达慢病毒载体的构建和包装及鉴定

目的构建神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因慢病毒载体,检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达。方法体外扩增NT-3,将NT-3全长载体GV287-GFP与扩增出的NT-3用AgeI进行酶切,将NT-3全长序列克隆入GV-287-GFP,转化大肠杆菌DHS a感受态细胞,筛选出阳性克隆进行基因测序。重组GV287-EGFP质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三质粒共转染至包装细胞293T,培养48 h后收集细胞上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在MSCs的转染效率。荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测MSCs细胞中NT-3蛋白的表达。结果测序结果和Western blot检测均证明NT-3慢病毒载体构建正确,且在细胞中正确表达。与辅助质粒共包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MSCs细胞。包装慢病毒、浓缩病毒悬液的滴度为2×109/ml慢病毒浓缩液。结论成功构建了稳定高效表达NT-3基因的慢病毒载体。     

表达大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)腺相关病毒的构建及体外表达分析

目的构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并检测体外表达目的基因的能力。方法应用基因克隆技术将大鼠BDNF的cDNA基因序列克隆入腺病毒质粒pAAV-MCS,PCR酶切测序鉴定序列。与AAV病毒包装质粒pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到含转基因过表达BDNF的病毒载体(rAAV-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况,用ELISA法测定培养液中表达产物浓度。结果证实BDNFcDNA片段插入到病毒基因组内,并整合到宿主基因组后稳定表达,病毒滴度可以达到1.29×108PFU/mL。重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF,ELISA结果表明,Hela细胞从病毒感染后第2天到第10天表达BDNF水平呈上升趋势,第10天达到2253pg/mL。结论成功地构建了表达BDNF基因的腺相关病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究奠定了方法学基础。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。 目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。 方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。 结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

大鼠GAD65基因慢病毒载体的构建及其在MSCs中的表达

目的构建谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)重组慢病毒表达载体,感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并进行鉴定。方法 PCR法扩增GAD65基因,构建LV5-GFP-GAD65慢病毒载体;与包装质粒共转染293T细胞包装病毒;将慢病毒感染大鼠MSCs,荧光显微镜鉴定转染率,Western blot检测GAD65的表达。结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-GAD65慢病毒载体构建成功;包装病毒产生的病毒液滴度为5×107TU/ml;慢病毒感染大鼠MSCs的转染率高于90%,Western blot结果显示GAD65蛋白表达比对照组明显升高。结论 GAD65重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染大鼠MSCs能稳定过表达GAD65蛋白,为进一步探索侧脑室注射基因化的MSCs治疗癫痫奠定实验基础。     

肿瘤血管抑制肽alphastatin重组腺伴随病毒的制备

目的构建并产生肿瘤血管抑制肽alphastatin(Al)重组腺伴随病毒(rAAV)载体。方法将目的基因alphastatin插入载体质粒pSSHG-巨细胞病毒(CMV)的EcoRI和BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-Al。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,使用三质粒共转染法转染293细胞,包装得到腺伴随病毒(AAV)-Al。采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀回收纯化,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果重组病毒rAAV-Al滴度约为2×1012颗粒/ml。结论成功制备了重组病毒rAAV-Al,提供了一种生产足量安全的rAAV-Al简单易行的方法,为肿瘤的基因治疗实验奠定了基础。     

酪氨酸羟化酶和核受体相关因子1基因共转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：探讨增强核受体相关因子1（Nurr1）表达对酪氟酸羟化酶（TH）基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）中THmRNA的表达,以及对MSCs表达TH阳性细胞数的影响。方法：TH转染组（TH组）和TH与Nurr1共同转染组（Nurrl-TH组）转染10d后,用半定量RT—PCR检测THmRNA的表达,细胞免疫化学方法检测TH的表达。结果：Nurr1—TH组THmRNA表达相对水平和MSCs内TH阳性细胞百分率均高于TH组（P〉0．05）;空白质粒对照组未检测到TH表达。结论：TH基因修饰的MSCs能高效稳定的表达THmRNA,Nurr1能显著增强TH修饰的MSCs中THmRNA的表达和TH阳性细胞数,为下一步移植治疗帕金森病奠定了基础。     

GDNF和GM1体外联合诱导骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的应用GDNF和GM1体外联合诱导MSCs转化为多巴胺能(DA)神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,密度梯度离心法分离获取单个核细胞。进行MSCs的体外培养和传代扩增。采用贴壁培养法使MSCs得到纯化。依据加入的神经营养因子不同分为对照组及实验组(GM1组、GDNF组、GDNF GM1组)。诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在诱导第3天、第7天进行NSE、GFAP、TH免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。采用SPSS10.0软件进行统计学处理。结果对照组可见少量NSE阳性细胞。各实验组比较发现,GDNF GM1组NSE阳性细胞率最高,GDNF组次之,GM1组最低。单独应用GDNF和GM1不能诱导MSCs表达TH,联合应用GDNF和GM1可诱导MSCs表达TH。随着诱导时间的延长,TH阳性表达增加。结论GDNF能够单独诱导MSCs向神经元样细胞分化,GM1不能单独诱导MSCs分化为神经元样细胞,但与GDNF联合,不仅可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,而且部分细胞能够表达TH。     

Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells

Bone marrow stromal cells (MSCs) are multipotent stem cells that have the potential to differentiate into bone, cartilage, fat and muscle. We now demonstrate that MSCs can be induced to differentiate into cells with Schwann cell characteristics, capable of eliciting peripheral nervous system regeneration in adult rats. MSCs treated with beta-mercaptoethanol followed by retinoic acid and cultured in the presence of forskolin, basic-FGF, PDGF and heregulin, changed morphologically into cells resembling primary cultured Schwann cells and expressing p75, S-100, GFAP and O4. The MSCs were genetically engineered by transduction with retrovirus encoding green fluorescent protein (GFP), and then differentiated by treatment with factors described above. They were transplanted into the cut ends of sciatic nerves, which then responded with vigorous nerve fibre regeneration within 3 weeks of the operation. Myelination of regenerated fibers by GFP-expressing MSCs was recognized using confocal and immunoelectron microscopy. The results suggest that MSCs are able to differentiate into myelinating cells, capable of supporting nerve fibre re-growth, and they can therefore be applied to induce nerve regeneration.     

稳定表达GDNF／EGFP融合基因的骨髓基质干细胞对多巴胺能神经元的保护作用

目的　 构建GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞 ,并观察其对多巴胺能神经元的营养支持作用。方法　 应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片段 ,以pEGFP C1为载体导入骨髓基质干细胞 (MSCs) ,制备稳定表达GDNF/EGFP融合基因的MSCs工程细胞 ,用联合培养的技术通过倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞与多巴胺能神经元的相互作用。 结果　MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞共培养均能促进多巴胺能神经元的存活和生长 ,MSCs工程细胞作用更强。 结论　 成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞 ,该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用 ,在帕金森病治疗中可能有重要价值     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

骨髓基质细胞立体定向移植治疗大鼠脑缺血损伤的实验研究

目的:观察骨髓基质细胞立体定向移植对大鼠脑缺血损伤后神经功能恢复的作用并探讨其作用机制。方法:制作SD大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO);体外培养骨髓基质细胞,观察其生物学特性以及立体定向移植后对脑缺血损伤后神经功能改善情况。结果:骨髓基质细胞体外可以长期传代、扩增,分泌NGF、VEGF等多种神经保护性因子;立体定向移植后,骨髓基质细胞在脑内存活、迁徙,小部分分化成具有神经元表面标志的细胞,与对照组相比,骨髓基质细胞移植组神经功能改善情况好于对照组。结论:骨髓基质细胞具有多向分化潜能,表达并分泌多种神经保护性营养因子。立体定向移植MSCs,对改善脑缺血损伤后的神经功能状况具有积极作用。     

Therapeutic benefit of TH-engineered mesenchymal stem cells for Parkinson's disease

The present study was designed to assess the potential of marrow stromal cells (MSCs) to deliver therapeutic genes to the brain and result in biologically significant functional recovery. The tyrosine hydroxylase (TH) gene was transfected to MSCs with an adeno-associated virus (AAV) vector. MSCs expressing TH gene were transplanted into the striatum of Parkinson's disease (PD) rat. The asymmetric rotation of these models after apomorphine administration was detected every week after transplantation. Six weeks after grafting, animals were sacrificed. Some brains were sectioned to do TH immunohistochemistry. The others were used to detect the dopamine levels by high-performance liquid chromatograph and electrochemical detection (HPLC-ECD). The results showed that MSCs multiply rapidly and formed fibroblast colony-forming units in primary culture. The gene expression efficiency was about 75%. The rounds of asymmetric rotation after apomorphine administration decreased after TH-engineered MSCs were grafted. Histological examination showed that TH gene was expressed around the transplantation points. The dopamine level in the lesioned striatum of rats injected with TH-MSCs was significantly greater than that in rats treated with LacZ-MSCs (P < 0.05). All the data demonstrated that MSCs could readily be genetically engineered. Therefore, MSCs could be useful gene delivery vehicles of gene therapy for Parkinson's disease.     

大鼠骨髓间质干细胞可以成为PEX基因稳定转染的载体细胞吗？*★

背景：PEX基因能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为，而骨髓间质干细胞是一种靶向肿瘤治疗的新型细胞载体。 目的：建立稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞。 方法：采用分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体，酶切测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-PEX，并转染大鼠骨髓间质干细胞，免疫细胞化学法验证真核表达载体在骨髓间质干细胞中的表达。通过G418筛选建立稳定表达PEX基因的骨髓间质干细胞，并用RT-PCR法检测PEX基因的表达。 结果与结论：实验成功构建稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞，基因水平和蛋白水平检测结果表明，PEX在转染的骨髓间质干细胞中呈高表达。     

Effects of pcDNA3-β-NGF Gene-modified BMSC on the Rat Model of Parkinson’s Disease

This study determined the effects of pcDNA3-beta-nerve growth factor (NGF) gene-modified bone marrow stromal cells (BMSC) on the rat model of Parkinson's disease (PD). The recombinant plasmid pcDNA3-beta-NGF was transfected into BMSC, and NGF expression and its biological activity in vitro were detected. BMSC modified by the NGF gene were then grafted into the corpus striatum of PD rats, and the rotation behavior was evaluated at 1, 2, 4, and 6 weeks post-transplantation. A significant improvement in rotation behavior was observed in PD rats subjected to cell transplantation, especially in PD rats receiving NGF-modified BMSC. The genetically modified BMSC survived and expressed beta-NGF but did not differentiate into tyrosine hydroxylase-positive cells in vivo. The present findings suggested that genetically modified BMSC could be effective for PD treatment, and the mechanisms might involve the neuroprotective effects of beta-NGF.