广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的 通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DV1)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析,了解各流行株之间的遗传差异,追踪其可能的传染来源。方法 应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因,克隆到PMD18-T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定,应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析,并绘制基因系统发生树。结果 3株DV1病毒E基因序列长度均为1485bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性在91%~98%之间,推测的氨基酸序列同源性在94%~99%之间。GD23/95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95%(98%),与其他株的同源性相对较低,2株属同一基因型;GD14/97和GD05/99与Cambodia共享序列非常接近,3株同属另一基因型。结论 广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析

目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况。方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定，并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果在9份样品中共分离到流感病毒3株，经血清学试验鉴定为甲3型。与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98．2％-98．3％，氨基酸同源性为96．7％-97．3％；与2003年流行株的核苷酸同源性为98．7％，氨基酸同源性为97．6％；与参考株A／Sydney／05／1997的核苷酸同源性为95．9％，氨基酸同源性为92．7％；与参考株A／Wuhan／359／1995的核苷酸同源性为94．6％，氨基酸同源性为91．2％。结论2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型。其HA1区序列更接近2003年流行毒株，与A／Sydney／05／1997毒株的同源性要高于A／Wuhan／359／1995。该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株。命名为Beijing（H）株。遗传分析表明Beijing（H）株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97．6％～99．1％和97．5％～99．7％。推导的氨基酸序列同源性分别是97．6％-99．2％和97．7％-99.8％。结论Beijing（H）株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。     

扬州地方株HPV16 L1基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地方株HPV16L1基因结构特点,为研制HPV16疫苗奠定基础。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA,用PCR技术获得HPV16L1基因,以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株与德国标准株在核苷酸序列上有7处不同,其中4处由于核苷酸的改变,其编码氨基酸也相应发生变化,与标准株的同源性为99．7％;扬州地方株与中国株之间也存在1至2处核苷酸不同,但未造成氨基酸序列改变,其同源性为99．9％。结论：扬州地方株HPV16L1基因与标准株、中国株之间均存在差异,但与后者的差异极小,未造成氨基酸改变。     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

一株输血传播病毒新变种的克隆和序列分析

目的：从1例不明原因转氨酶升高的病人血清中克隆输血传播病毒（TTV）DNA，并进行序列分析。方法：用巢式PCR扩增TTVDNA长片段，连接至pGEM-T载体上，挑选一个克隆（56－B）进行测序，将56－B与GenBank中五株TTV进行氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，并用最大似然法进行分子进化分析。结果：56－B株与TA278等五株TTV序列的核苷酸同源性分别为42．4％，48．2％，47．9％，61．7％，氨基酸序列的同源性更低，但其5'，和3'两端非编码区的序列仍然很保守。结论：56－B株与其他TTV株之间的同源性很低，有很高的基因异质性，是TT的一个新变种，代表TTV的一个新的基因型。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型Stocker株gD膜外区基因的克隆与序列测定

目的：为了克隆单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV－1）gD膜外区基因。方法：采用Vero细胞培养HSV－I Stocker株,并提取病毒DNA作为PCR模板。PCR扩增出的gD片段经EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切,插入质粒pB220相应位点,转化E.coliDH5α。重组质粒经PCR、酶切鉴定命名为pBV220-gD。对克隆的HSV－I Stocker株gD基因进行序列,并与其他HSV－Ⅰ,ⅡgD基因相应部分进行比较。结果：核苷酸序列同源性分别为99．77％、86．55％,氨基酸序列同源性分别为99．31％、88．28％。结论：SHV－Ⅰ gD基因的克隆为表达该基因,进一步研制重组抗原诊断试剂、研究亚单位疫苗及gD,gD受体的结构功能奠定了基础。     

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析。寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT—PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明．该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90．8％、97．6％、100％和99．6％。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染。与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同．并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。     

2003年广州市登革1型病毒流行株的分离及NS2基因序列分析

目的对广州市区2003年仲夏—批疑似登革病毒感染的患进行确诊，并从基因水平分析流行株的可能来源。方法用免疫层析法(ICT)检测早期疑似患的DV—IgN和IgG抗体；同时用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)、细胞培养病毒分离分别进行病原的分离和鉴定；对所分离到的毒株进行基因克隆、测序，并与国际参考株及国内流行株相应的序列进行同源性分析，结合患的流行病学资料推测本次流行株的可能来源。结果发病5d内患DV—IgM抗体阳性率为56．5％(13／23)，发病5～10d的患DV—IgM抗体阳性率为66．7％(16／24)；DV—IgG抗体无1例阳性。从18份发病5d内患的血标本中分离病毒7份，经RT—PCR和基因测序检测证实为DVI感染；用RT—PER检测30份早期患血标本，患的阳性率为83．3％(25／30)。基因序列分析表明，2003年流行株与登革1型病毒柬埔寨流行株及我国1997、1999年登革1型病毒流行株的同源性最高，分别为97％、97％、98％。所有患在发病前两个月均在广州市区某大院内居住，无输血史、无外出史。结论2003年广州登革热流行为登革1型病毒感染所致，推测广东可能存在登革1型病毒的疫源地。     

广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区（NCR）长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02,GZ/218/2002）,1995年广东分离株（GD23/95,GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型;而1999年广东分离株（GD05/99）,1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：71/     

辽宁省锦州市首例输入性登革热病例的调查、快速检测方法与防控探讨

目的通过调查总结输入性登革热的防治经验,并建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革热病毒,更好地指导今后登革热防制工作。方法流行病学调查,利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3’端非编码区一段序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和探针,以DF病毒株作为标准,以乙脑毒株作阴性对照,建立荧光PCR检测DF的快速方法。同时给予1份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行荧光PCR扩增。结果采用PCR引物对登革1~4型病毒进行扩增,与设计相符;而乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果,1份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83.3%(25/30),其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14/97、GD05/99同源性分别为97%。结论在今后的登革热防控工作中,我们应用RT-PCR检测方法时间短、灵敏性高、有较高的特异性,以此作为为DF的临床早期诊断方法;其次重点加强出国和归国人员的管理,开展登革热防治知识的宣传教育,建立和其他部门的登革热联防体制,加强基层医务人员登革热防治知识培训,提高基层医务人员登革热诊治水平,来达到控制登革热的目标。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

东莞市2014—2017年Ⅰ型登革病毒流行情况及E基因序列分析

目的 研究2014—2017年东莞市Ⅰ型登革病毒（DENV-1）流行情况,分析其可能的地域来源及基因特征。方法 采用实时荧光PCR方法对2014—2017年东莞市疾病预防控制中心收到的登革热疫情样本进行核酸检测分型,阳性标本进行病毒分离及鉴定,扩增并测定部分分离株E基因序列,共得到8株DENV-1及其E基因序列,与Genebank中选取的世界各地DENV-1流行株及原型株进行参考对比,用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,用Mega4.0.2软件进行分子分型和系统进化树构建。结果 665份标本中DENV阳性251份,其中DENV-1阳性占90.0%。以9月、10月为发病高峰期,占86.7%;男女比例为0.92∶1,20~<70岁年龄组发病例数最多,占75.1%;DENV-1阳性本地病例以虎门、麻涌、南城、厚街和莞城五个镇街最多,占76.4%。序列比对显示,8株DENV-1的E基因序列核苷酸同源性为90.2%~99.6%,氨基酸同源性为96.4%~100.0%,与选取的近年世界各地流行株的核苷酸与氨基酸同源性分别为89.2%~100.0%和90.2%~100.0%。系统进化树分析显示,2014—2017年东莞8株DENV-1分离株与我国广州、深圳及新加坡、马来西亚等东南亚国家当年或往年DENV-1流行株同源性较高,分属基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型 ,但以基因Ⅰ、Ⅴ型为主。所有8株分离株与原型株进化距离较远。结论 2014—2017年东莞市登革病毒流行以DENV-1为主,流行基因亚型主要为基因Ⅰ型和基因Ⅴ型,流行方式为广深等周边地市及新加坡、马来西亚等东南亚各国输入病例引起的本地暴发流行。     

中国南方人群CD40基因多态性与Grave's病的相关性研究

目的 探讨CD40基因5'非翻译区（5'UTR）_1位点的C/T单核苷酸多态性(SNP)与广东汉族人群Graves病（GD）的易感相关性。 方法 采用病例－对照研究方法，对119名广东汉族人群GD患者和103名正常对照者进行研究。应用聚合酶链反应－限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）技术测定CD40基因5'UTR _1位点的C/T单核苷酸多态性，计算基因型及等位基因频率。结果 CD40基因5'UTR _1位点的基因型频率在GD组和对照组中的分布差异有显著性（X2＝14.152，P＝0.010），GD组的CC基因型频率明显高于对照组（47.9% vs 24.3%,OR值＝2.870，95％CI为 1.612～5.105，P=0.000），TT基因型频率明显低于对照组（16.0% vs 29.1%,OR值＝0.462，95％CI为 0.242～0.885，P=0.018），GD组的C等位基因频率明显高于对照组(66.0% vs 47.6%,OR值＝2.136，95％CI为1.456～3.133，P=0.004)。 结论 CD40基因5'UTR_1位点的C等位基因多态性可能与广东地区汉族Graves病发病相关。 [关键词]： CD40 Graves病 基因多态性