火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建

目的：构建用于基因工程疫苗制作的火鸡疱疹病毒（HVT）外源基因转移用载体。方法：利用PCR技术，从感染火鸡疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞（CEF）基因组中成功地扩增出火鸡疱疹病毒的繁殖非必须基因-US基因，将该PCR产物克隆进PGEM-T载体中，利用末端平滑化技术和连接反应，把报告基因LacZ基因插入到US基因中。结果：构建出了用于制作重组HVT病毒的转移载体。结论：本研究以LacZ作为报告基因，成功的将其插入到US基因中，为将来应用HVT基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

含TKglyES融合基因重组质粒的构建

目的：构建携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase，TK）及内皮抑素（Endostatin，ES）融合基因的重组质粒。方法：以pAdE1CMV—TK为模板，经聚合酶链反应（PCR）扩增TK片段，将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV，再以PET-19b—ES质粒为模板经PCR扩增glyES片段，将其插入TK片段的下游，构建成pAdTrackCMV—TKglyES。结果：酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）及内皮抑素（Endostatin）融合基因的重组质粒。结论：为进一步构建病毒载体用于肿瘤基因治疗打下基础。     

抑癌基因P16INK4在sf9细胞中的表达和鉴定

目的：利用杆状病毒表达系统在体外表达抑癌蛋白P16,为研究P16蛋白的结构与功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定基础。方法：（1）利用定向克隆的方法将P16全基因序列插入转移载体pSX-IVVI^ X3的EcoRI,SalI位点上,经氨苄青霉素平板初筛,菌落原位杂交、PCR扩增酶切电泳鉴定后,分离含P16的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;（2）用昆虫杆状病毒TnNPV-SVI-G感染sf9细胞扩增病毒,用PEG法沉淀病毒、酚/氯仿抽提纯化病毒DNA;（3）CaCl2沉淀法使重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16和病毒TnNPV-SVI-GDNA共转染sf9细胞,通过多角体观察和PCR法鉴定重组病毒;（4）经空斑纯化法纯化重组病毒,重组病毒感染草地夜蛾细胞（sf9)使P16大量表达,经SDS-PAGE及WesternBlot鉴定所表达的P16蛋白,结果：（1）筛选出两株含P16全基因的重组转移载体-pSXIVVI^ X3-16;（2）构建了含P16全基因序列的重组杆状病毒TnNPV-p16;(3)SDS-PAGE电泳显示重组病毒TnNPV-P16感染sf9细胞的培养上清及胞体裂解物和阳性对照Hela细胞裂解物在16kD左右均有蛋白条带,而阴性对照TnNPV-SVI-G感染的sf9细胞培养上清中无此蛋白条带,经免疫印迹染色证实此蛋白为抑癌蛋白P16。结论：利用我国自己构建的昆杆状病毒表达系统成功了表达P16蛋白,分子量大小及特异性与国外报道相同。     

hIL-2与ZsGreen双基因共表达腺相关病毒的包装及鉴定

[目的]包装并鉴定带有人白介素2（hIL-2）及ZsGreen的双基因共表达的重组5型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 5,rAAV5）,为今后利用5型重组腺相关病毒载体进行胰腺癌基因治疗提供研究基础。[方法]以5型腺相关病毒包装系统（helper-free system）为模版,PCR法扩增pLVX-IRES-ZsGreen和PES-IL-2模板上的IRES-ZsGreen和IL-2基因,利用酶切位点插入重组腺相关病毒骨架质粒,获得重组质粒pAAVhIL-2-IRES-ZsGreen。经三质粒共转染AAV293细胞包装重组腺相关病毒rAAV5-hIL-2-IRES-ZsGreen。荧光显微镜下检测病毒包装效率,超速离心纯化、浓缩重组病毒,qPCR测定病毒的滴度。重组病毒转导细胞经荧光显微镜检测、外源基因经PCR检测证实病毒包装结果。[结果]5型重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IL-2-IRES-ZsGreen经双酶切和测序鉴定,确定其序列正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV293细胞72h后,病毒包装效率达90%以上。5型重组病毒感染HEK 293细胞48h有荧光出现,重组病毒基因组成功扩增出外源基因IL-2,证明有感染力的重组病毒包装成功。[结论]成功包装带有hIL-2及ZsGreen标记的双基因共表达重组腺相关病毒,滴度达到2.62×1012。     

沙眼衣原体重组口服活疫苗的构建及其口服免疫的特性

目的 观察所构宾沙眼衣原体（Ｃｔ）重组疫苗株对小鼠的免疫特性。方法 以减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统为载体构建Ｃｔ重组疫苗株。将重组疫苗株用ＬＢ培养基连续传代５０次，比较传代前后携带质料、生化反应性及蛋白表达情况，以鉴定重组子的稳定性。并以不同浓度的重组菌活菌液口服免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，检测外源基因的插入和表达对减毒株毒性的影响，口服免疫后不同时间检测小鼠小肠Ｐｅｙｅｒ氏结、肠系膜淋巴结、脾脏及子宫     

狂犬病病毒糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性分析

目的:利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆?表达?纯化,并对重组 RVG 进行免疫学特性鉴定?方法:参照 GenBank 收录的狂犬病病毒 CVS-11 株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因?RVG 基因经BamHⅠ/KpnⅠ 双酶切后定向克隆到 pFastBac-GP67B 载体上,阳性重组转座质粒进一步转化E.Coli DH10Bac 感受态细胞,经蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后获得重组穿梭载体 rBacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达?His-TrapHP 纯化目的蛋白,SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定?重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性?结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000?经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性?结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础?     

弓形虫p30基因在真核系统中的表达

采用聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化克隆刚地弓形虫（Toxplasmagondii）p30基因的转移载体质粒pSXIVVI+X3－p30DNA；将pSXIVVI＋X3－p30DNA与粉纹夜蛾核型多角体缺陷型病毒TnNPV－SVI－GDNA共转染草地夜蛾（Sfg）细胞，构建出既能形成多角体又能表达外源基因的重组病毒TnNPV－p30。经空斑纯化挑选出6株单克隆重组病毒，感染细胞裂解液在相对分子质量约为34000～35000位置出现一条表达带；其含量占细胞总蛋白的5.13％～5．62％，株间差异不明显；用抗弓形虫多克隆抗血清进行Western－Blot呈一特异反应条带。感染后72h蛋白表达量最高，可达7．18％；96小时次之，为5．91％。