新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景：构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道。目的：观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达。方法：通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒（ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix）共转染293FT细胞。通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1～5mg/L嘌呤霉素筛选5d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析。结果与结论：经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群。     

新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景:构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道.目的:观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达.方法:通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞.通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选5 d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析.结果与结论:经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群.     

构建携带p73α基因的慢病毒表达载体及检测其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带p73α基因的慢病毒系统表达载体,成功感染人卵巢癌细胞PEO1后检测其蛋白质的表达。方法:将采用PCR技术获得全长p73α基因亚克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒PCDH-p73α,验证成功后与包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、Pvsv-G共转293T细胞,获得重组慢病毒Lenti p73α后感染靶细胞人卵巢癌细胞PEO1(p73α基因表达缺失)后,RT-PCR和Western Blotting验证PEO1细胞中Lenti p73α的表达。结果:经酶切鉴定及基因测序证实PCDH-p73α中携带正确的p73α基因序列,与GenBank中序列一致;转染包装细胞293T后产生慢病毒颗粒能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60%,并且存在p73α基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论:本实验成功构建了PCDH-p73α慢病毒表达载体,包装成功后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

靶向Arnt的RNAi慢病毒载体的构建及其在HCCLM6中对Arnt基因表达的影响

目的：构建并鉴定Arnt基因特异性RNAi慢病毒载体，将其导入HCCLM6肝癌细胞中，筛选有效抑制ARNT表达的稳定细胞株。方法：针对已经筛选确定的Arnt基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pLVTHM载体连接[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]产生LV-shArnt慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LV—shArnt载体，pCMV—dR8．74载体，pMD2G载体三质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白表达水平测定病毒滴度，挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染HCCLM6中，经过GFP筛选得到稳定抑制Arnt表达的HCCLM6细胞株，通过RT—PCR鉴定抑制Arnt表达的效果。结果：双酶切与测序鉴定证实成功构建了ArntshRNA的慢病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了HCCLM6，并且抑制了Arnt的表达。结论：运用pLVTHM载体构建的LV—shArnt慢病毒载体可有效抑制Arnt在肝癌细胞株HCCLM6中的表达，为观察转染shRNA慢病毒表达载体的肿瘤细胞的恶性生物学行为变化奠定了实验基础。     

慢病毒介导的血友病B基因在离体细胞中的表达

目的 构建泛醌启动子(PUB)驱动的携带犬凝血因子Ⅸ(cFⅨ)基因的慢病毒三质粒表达载体,将其包装成病毒后,观察是否能在体外获得有效的cFⅨ表达.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV-G和构建的重组转移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30±2.10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞. 移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30± .10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞.     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

本研究的目的是制备携带狗凝血因子Ⅷ（cFⅧ）基因的慢病毒载体,探讨慢病毒载体能否介导cFⅧ在体外的有效表达。用构建携带cFⅧ基因的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子）,同时构建含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pTK161′（含PUB启动子）和pTK162′（含2OH1启动子）的方法,分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞,检测病毒滴度和培养细胞上清中cFⅧ活性。结果显示：经限制性酶切鉴定,成功构建了pTK161、pTK162、pTK161′和pTK162′正向连接载体;pTK161′和pTK162′的病毒滴度分别为1.54×10^6U/ml和2.83×106U/ml;pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cFⅧ的表达,72小时表达量达高峰。pTK162载体cFⅧ表达活性接近正常狗血浆FⅧ活性,而且明显高于pTK161（p〈0.05）,6周后cFⅧ表达活性仍达最高值的1/4。结论：构建的自身失活慢病毒载体可携带较大片段的cFⅧ基因,并在体外可获得有效表达;本研究为慢病毒载体介导的血友病A的基因治疗研究提供实验依据。     

RPS14基NRNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干／祖细胞内RPSl4表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。目的：构建RPSl4基因HRNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。方法：针对已经筛选确定的RPSl4基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPSl4慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper1．0载体和pHelper2．0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度：并将获得的RPSl4shRNA慢病毒载体GC-shRPSl4转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用WestemBlot检测靶细胞内RPSl4蛋白的表达。结果与结论：经测序证实,构建出了了RPSl4shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×10^9TU／mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75％,WesternBlot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPSl4蛋白表达沉默。     

慢病毒介导可溶性肿瘤坏死因子受体1在小鼠骨髓未成熟树突状细胞中的表达(英文)

背景:肿瘤坏死因子α是介导树突状细胞成熟的重要细胞因子之一,可溶性肿瘤坏死因子受体1与其结合可阻断肿瘤坏死因子α的作用,维持树突状细胞于不成熟状态,诱导免疫耐受.目的:构建含有人sTNFR1的慢病毒表达载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达.方法:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出sTNFR1基因片段,亚克隆至慢病毒转移质粒pXZ208,通过IRES连接eGFP报告基因,建立双顺反子慢病毒转移质粒,命名为pXZ9-sTNFR1,DNA测序鉴定.采用脂质体转染293 FT细胞,根据报告基因eGFP测定病毒滴度.采用小剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4体外培养扩增C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞.培养第5天,以pXZ9-sTNFRl重组慢病毒上清感染未成熟树突状细胞,RT-PCR检测感染后sTNFRl转录,Westernblot法检测sTNFR1蛋白表达,观察sTNFR1基因修饰及脂多糖刺激后树突状细胞的表型特征.结果与结论:成功构建重组质粒pXZ9-sTNFR1,转染293 FT细胞24 h后观察到eGFP表达,病毒滴度在10~6U/L以上.RT-PCR显示pXZ9-sTNFR1感染的未成熟树突状细胞sTNFR1呈阳性表达,Western blot检测到sTNFR1蛋白存在于感染后未成熟树突状细胞和培养上清中.培养第5天的树突状细胞低表达CD40、CD86、CD80和MHCⅡ类分子,脂多糖刺激后,高表达MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子,显示出成熟型树突状细胞表型特征,sTNFR修饰的树突状细胞MHC Ⅱ类分子和CD40、CD80、CD86分子表达水平无变化.提示:①成功构建了负载sTNFR1基因片段及含eGFP报告基因的慢病毒载体,获得了高滴度的重组慢病毒颗粒.②经慢病毒高效转导的未成熟树突状细胞sTNFR1 mRNA及蛋白稳定地表达,可以保护未成熟树突状细胞不被外源性脂多糖刺激活化,维持树突状细胞于非成熟状态.     

干预ERRα的表达对体外培养的多发性骨髓瘤细胞MM.1S的凋亡诱导作用

目的:探讨两种不同的干预ERRα基因的表达和活性策略对人多发性骨髓瘤细胞株MM.1S凋亡的影响.方法:第一种策略是设计并构建靶向人ERRα基因的shRNA慢病毒载体,利用293T细胞包装慢病毒后感染骨髓瘤细胞株MM.1S,经嘌呤霉素筛选得到敲低ERRα的稳转细胞株.另一种策略是使用ERRα的特异性反向激动剂XCT790...     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题.应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题.目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装.方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒.用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序.抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因.pMD1 8-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒.     

B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立

目的 构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,观察其在体外培养细胞中的表达情况.方法 用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因(BDDhFⅧ cDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点,构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向.采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒,包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝(Chang-Liver)细胞和成人骨髓基质细胞(MSC),并以pXZ171作为对照.流式细胞术(FCM)检测载体的感染效率,一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果 成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,包装后能有效感染多种靶细胞,感染效率分别为:HLF细胞(74.52±7.57)%、MSC(42.34±5.84)%和Chang-Live细胞(27.24±6.53)%.感染后48 h检测到HLF细胞、Chang-Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达,FⅧ活性分别为(54.1±5.6)%、(22.5±2.9)%和(12.5±2.7)%.PCR检测到目的 基因的整合.结论 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ.     

携带人Gfi1基因重组慢病毒载体稳定转染32D细胞株的建立

本研究建立真核细胞表达的Gfi1基因重组慢病毒载体包装系统,并实现Gfi1在32D细胞中长期、稳定的表达,为进一步研究Gfi1基因在恶性血液病中的发生发展建立一个有效的平台。制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pLOX—Gfi1／pLOX）、包装质粒（pCMVAR8．2）及包膜蛋白质粒（pMD．G）。用脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,48小时后收集病毒上清,并转染靶细胞32D;用Western—blot法检测293T及32D细胞中Gfi1的整合及表达。结果表明：慢病毒的3种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出慢病毒。目的基因Gfi1能被重组慢病毒高效导入靶细胞32D,并稳定表达,在荧光显微镜下可直接观察到GFP。Western—blot能检测到Gfi1蛋白在包装细胞293T及32D细胞中的表达。结论：慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞并持续表达,证明本研究建立了一种有效的基因转移系统。     

PTEN基因重组慢病毒的构建

目的:构建PTEN基因重组慢病毒,转染真核细胞Ishikawa并检测PTEN基因在真核细胞内的表达.方法:分子克隆重组人PTEN基因与含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体PLIG,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组子PLIG-PTEN和包装质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,感染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基因在细胞内的表达,使用RT-PCR和western-blot检测PIEN基因在细胞内的表达水平.结果:PCR和测序证实,成功克隆慢病毒载体PLIG-PTEN,包装慢病毒,感染真核细胞Ishikawa后48 h,观察到绿色荧光的广泛表述并检测出宿主细胞内表达的PTENmRNA成功表达PTEN蛋白.结论:本实验成功地构建了人PTEN基因慢病毒载体,并观察到PTEN基因在真核细胞中的成功表达.     

钠钙交换体启动子促进诱导多能干细胞向心肌细胞转化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：探讨钠钙交换体（NCX1）启动子诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的作用。 方法：构建含钠钙交换体1启动子的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒质粒,使用ViraPowerTM慢病毒包装系统共转染293FT细胞。收集病毒测定病毒滴度后感染小鼠诱导多能干细胞,并使用嘌呤霉素进行筛选。观察胚状体数量以及诱导多能干细胞的分化效率,使用RT-PCR、免疫荧光分析法检测心肌特异标记物。 结果与结论：成功构建了含钠钙交换体1启动子的pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒,感染小鼠诱导多能干细胞后使用流式细胞仪分选NCX1^＋/GFP^＋细胞。与NCX1^-/GFP-细胞相比,NCX1^＋/GFP^＋细胞在4 d即出现细胞分化和跳动,NCX1＋细胞GATA4/MEF2c/Nkx2.5基因表达分别是NCX1^-细胞的4.2,7.5,2.5倍,免疫荧光显示CX43和心肌肌钙蛋白I呈阳性表达。结果表明,钠钙交换体1启动子可以促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化。     

端粒酶hTERT亚单位启动子靶向性慢病毒对肿瘤活体实时显像的实验研究

目的构建一种含优化型人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的慢病毒,结合小动物活体光学成像系统,研究该启动子对端粒酶阳性肿瘤的特异性活体成像作用。方法将文献报道的优化型hTERT启动子克隆到pGL-Basic质粒,对优化型hTERT启动子进行功能检测。确定其驱动活性之后,构建一种含该启动子和GFP的第3代慢病毒表达系统,以含CMV启动子的慢病毒作为对照。采用小动物荧光成像系统体内外研究优化型hTERT启动子在肿瘤实时诊断中的作用。结果启动子功能检测发现hTERT启动子具有严格的端粒酶阳性肿瘤细胞特异性,并且具有很高的报告基因报答水平。第3代慢病毒包装系统获得了高滴度的病毒颗粒并且能高效整合报告基因之宿主细胞。体外研究表明,含有优化型hTERT启动子的慢病毒体外感染细胞后,能够在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达GFP,并且能维持长达40d的报告基因表达时间。体内实验发现,感染含优化型hTERT启动子的慢病毒之后24h,端粒酶阳性活体肿瘤能够被特异性的实时观察到,并且肿瘤内的GFP信号在存活裸鼠体内维持30d,随肿瘤增大而增强。结论优化后hTERT启动子对报告基因的调控具有严格的端粒酶特异性,第3代慢病毒系统可将该启动子和报告基因整合至细胞基因组,并实现在端粒酶阳性肿瘤细胞内的特异表达。结合小动物活体光学成像系统,荷瘤裸鼠内的端粒酶阳性肿瘤能够被无创的、实时的、特异性的成像,为肿瘤的特异性早期诊断提供新的实验理论基础。     

慢病毒荧光素酶载体介导的miRNA靶向基因筛选系统的建立及应用

本研究旨在建立miRNA靶基因高通量筛选系统,筛选出能调控p21NAs,以便试验验证及探索这些miRNA的生物学功能及意义。利用分子克隆技术构建并鉴定2个慢病毒表达载体-pWPXL-Luc及pWPXL-Luc-P21-3’UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2G共转染HEK 293T细胞;包装病毒颗粒,感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与P21-3’UTR的细胞株,前者在后续实验中作为对照;采用荧光素酶检测试剂检测pWPXL-Luc病毒感染后的293细胞的荧光素酶活性。结果表明:包装出高滴度的病毒颗粒,成功建立稳定株,且在一定范围内稳定株细胞的荧光素酶活性与细胞数目成正比。结论:成功建立了miRNA靶基因高通量筛选系统;利用本筛选系统,成功筛选出靶向细胞周期调控基因P21(CIP1/WAF1)的miRNA。     

人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能。方法以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶NotⅠ和NsiⅠ酶切、T4DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒;浓缩假病毒后测定其滴度为2×109TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70%以上。PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2CmRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(t=11.93,P=0.000)。结论成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础。