慢病毒介导的血友病B基因在离体细胞中的表达

目的 构建泛醌启动子(PUB)驱动的携带犬凝血因子Ⅸ(cFⅨ)基因的慢病毒三质粒表达载体,将其包装成病毒后,观察是否能在体外获得有效的cFⅨ表达.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV-G和构建的重组转移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30±2.10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞. 移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30± .10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。     

靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建hTERT 基因RNAi 慢病毒载体,为大肠癌RNAi 介导的基因治疗打下基础.方法 化学合成3 条靶向hTERT 基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48 h 后采用RT-PCR 方法筛选出一条对hTERT mRNA 有明显抑制作用的siRNA.针对已经筛选确定的hTERT 基因RNAi 有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体[含U6 启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev 和pVSV-G 4 质粒共转染包装细胞293T 细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP 蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR 和测序证实,成功构建hTERT shRNA 的慢病毒载体LV-shhTERT.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1 ×108 UT/ml.结论 成功构建了hTERT 基因RNAi 慢病毒载体.     

人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立

目的 构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,观察其在体外培养细胞中的表达情况.方法 用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因(BDDhFⅧ cDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点,构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向.采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒,包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝(Chang-Liver)细胞和成人骨髓基质细胞(MSC),并以pXZ171作为对照.流式细胞术(FCM)检测载体的感染效率,一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果 成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,包装后能有效感染多种靶细胞,感染效率分别为:HLF细胞(74.52±7.57)%、MSC(42.34±5.84)%和Chang-Live细胞(27.24±6.53)%.感染后48 h检测到HLF细胞、Chang-Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达,FⅧ活性分别为(54.1±5.6)%、(22.5±2.9)%和(12.5±2.7)%.PCR检测到目的 基因的整合.结论 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ.     

靶向Arnt的RNAi慢病毒载体的构建及其在HCCLM6中对Arnt基因表达的影响

目的：构建并鉴定Arnt基因特异性RNAi慢病毒载体，将其导入HCCLM6肝癌细胞中，筛选有效抑制ARNT表达的稳定细胞株。方法：针对已经筛选确定的Arnt基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pLVTHM载体连接[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]产生LV-shArnt慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LV—shArnt载体，pCMV—dR8．74载体，pMD2G载体三质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白表达水平测定病毒滴度，挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染HCCLM6中，经过GFP筛选得到稳定抑制Arnt表达的HCCLM6细胞株，通过RT—PCR鉴定抑制Arnt表达的效果。结果：双酶切与测序鉴定证实成功构建了ArntshRNA的慢病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了HCCLM6，并且抑制了Arnt的表达。结论：运用pLVTHM载体构建的LV—shArnt慢病毒载体可有效抑制Arnt在肝癌细胞株HCCLM6中的表达，为观察转染shRNA慢病毒表达载体的肿瘤细胞的恶性生物学行为变化奠定了实验基础。     

小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

人EZH2基因编码区及3’非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达。方法运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。Western blot检测mCherry-EZH2的表达。结果测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白。结论成功构建人EZH2基因CDS区及3’UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达。为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3’UTR表达的miRNA奠定前期实验基础。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景:Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何?目的:构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法:针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论:测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

利用RPS6启动子实现凝血因子的稳定表达

目的：筛选得到更优启动子，为血友病基础研究和基因治疗提供更有力的工具。方法：用生物信息学方法分析高丰度表达持家基因的启动子，遴选潜在候选启动子；构建GFP报告基因载体，以EF1α启动子为对照，考察新型启动子载体的包装效率及报告基因的转录和活性；装载F9基因，考察候选启动子的活力。结果：筛选得到最具潜力的RPS6启动子；RPS6pro-LV和EF1αpro-LV在慢病毒包装上没有差异，二者病毒滴度一致。在293T细胞中，RPS6proLV和EF1αpro-LV的转导效率、平均荧光强度与慢病毒剂量成正比。两种启动子在不同类型细胞中的转导效率均呈现293T>HEL>MSC的规律；相较于EF1αpro-LV,RPS6pro-LV在MSC细胞中具有更高的荧光强度；对感染两种启动子病毒的HEL细胞进行长期培养，发现RPS6pro-LV具有更稳定的活性。K562细胞RT-q PCR、Western blot及细胞培养上清FIX活性（FIX∶C）检测结果显示，EF1α-F9、RPS6-F9组FIX表达均高于空载对照组，EF1α-F9与RPS6-F9组之间FIX表达量无显著差异。结论：经筛选...     

视锥视杆细胞同源盒基因的慢病毒载体的构建

目的 构建视紫红质启动子(rhodopsin,Rho)驱动的、大鼠视锥视杆细胞同源盒基因(cone-rod homeobox gene,CRX)为目的基因的重组慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX,研究其在体外的转染效率.方法 用PCR法扩增质粒pEGFP-C3/CRX中的EGFP/CRX基因片段,取代慢病毒载体LV-Rho-EGFP中的EGFP片段,构建表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,经酶切和双向测序验证.用磷酸钙沉淀法四质粒共转染293T细胞,包装、收集病毒,利用有限稀释法测定病毒滴度.用慢病毒原液感染光感受器细胞来源的人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44,观察感染情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV-Rho-EGFP/CRX,产生的慢病毒滴度为2×104 IU/ml,感染48h后,HXO-RB44细胞内可见强弱不等的绿色荧光.结论 重组载体LV-Rho-EGFP/CRX产生的慢病毒能感染光感受器细胞来源的HXO-RB44细胞,但还需提高转染的效率和滴度.     

表达红色荧光蛋白的小鼠淋巴瘤EIA细胞株的建立及鉴定

本研究通过慢病毒载体将红色荧光蛋白（DsRed）导入小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立稳定高表达DsRed的EL4／DsRed细胞株,为建立携带红色荧光标记的小鼠肿瘤模型奠定基础。构建含新霉素耐药基因（neo）、内部核糖体进入位点序列（IRES）及DsRed的双顺反子自身失活型慢病毒载体。采用脂质体转染法将慢病毒三质粒包装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞,收集病毒上清,感染EL4细胞;利用G418的药物选择特性筛选感染细胞获得稳定表达DsRed的EL4细胞株,并扩大培养。结果表明：成功构建慢病毒表达质粒pXZ208-neo-IRES-DsRed,包装的重组慢病毒滴度可迭10^6U／ml。病毒感染EL4细胞,经终浓度为600μg／ml的G418成功筛选出稳定携带DsRed的EL4／DsRed细胞株;荧光显微镜观察及流式细胞仪检测证实该细胞株长期稳定高表达DsRed。结论：通过表达DsRed的慢病毒载体感染ELA细胞,获得了稳定高表达DsRed的EL4／DsRed细胞株。     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增（PCR）目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH—KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT—PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。     

携带小鼠RORγt基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293FT细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208,生成pXZ9-RORγt。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,以Western blot鉴定RORγt的表达。结果表明,RT-PCR扩增出RORγt基因并克隆入PCR2.1T载体;经亚克隆构建了慢病毒转移质粒XZ9-RORγt。质粒经脂质体转染293FT细胞获慢病毒颗粒,慢病毒颗粒体外高效感染293FT细胞,感染后Western blot检测到RORγt蛋白表达。结论：成功构建慢病毒载体pXZ9-RORγt,并在293细胞内获得表达。     

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数（MOI）50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能。方法以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶NotⅠ和NsiⅠ酶切、T4DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒;浓缩假病毒后测定其滴度为2×109TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70%以上。PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2CmRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(t=11.93,P=0.000)。结论成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%（P〈0.05）。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。