重组结核分枝杆菌1600O蛋白抗原(rPA16)豚鼠皮肤试验效果的研究

目的以豚鼠为动物模型,分析重组16000蛋白抗原rPA16能否引起迟发型超敏反应(DTH)。方法连续3次皮下注射结核分枝杆菌H37Rv热灭活菌体,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照,PPD为阳性对照组,重组蛋白则设置0.1,0.2,0.4μg三个剂量,分别进行背部皮内注射,注射后24～72h观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果0.1～0.4/0.2ml的重组蛋白抗原rPA16在48～72h阳性反应平均直径与PPD相比均无显著差异(均P＞0.1),3种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著差异(P＞0.1)。48h为rPA16引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论重组结核分枝杆菌16000蛋白抗原与PPD相比,所引起的豚鼠皮肤DTH的反应能力基本相似,具有皮肤试验的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论 :从我们的实验结果来看重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH反应可以代替PPD     

重组结核分支杆菌 38000 蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应

目的：研究重组结核分支杆菌38000蛋白诱发豚鼠迟发型超敏(DTH)反应的特异性及其作为皮试诊断品的可行性。方法：皮肤试剂轮圈法：将豚鼠分为5组、每组5只，分别为H37Rv全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏备用。生理盐水为阴性对照，5 IU国际标准品PPD为阳性对照。将0.2μg 38000蛋白质分别注入每只致敏豚鼠的背部双侧皮肤。于注射后24，48h分别测量红肿或硬结的纵、横径，并记录两者平均值。结果：PPD与所有受试分支杆菌致敏的豚鼠均产生较强的DTH反应。重组38000蛋白对结核分支杆菌致敏豚鼠所产生的DTH反应与PPD相似，而对堪萨斯和偶发分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。结论：38000蛋白诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似，而特异性高于PPD，可替代PPD成为一种新的特异性皮肤诊断试剂。     

结核分枝杆菌rCFP10—ESAT6融合蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的实验研究

目的探讨以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原用皮试法评价其对结核分枝杆菌（Mtb）和卡介苗（BCG）致敏豚鼠的鉴别意义。 方法分别用灭活H37Rv和BCG活菌致敏豚鼠．4wk后用不同剂量的rCFP10—ESAT6对同一只豚鼠作皮试，同时设立5IU结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）阳性对照及生理盐水（NS）阴性对照，于注射后24、48、72h测量红肿或硬结的直径。 结果以rCFP10-ESAT6为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为100．0％（21／21）、90．9％（10／11），以PPD为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为47．6％（10／21）、90．9％（10／11），以rCFP10-ESAT6为抗原的迟发型超敏反应（DTH）中，以1．0μg剂量效果最好．观察时间以皮试后24h效果最好，1．0μg重组融合蛋白在Mtb致敏豚鼠上引发的红肿、硬结比5IU PPD引发的红肿、硬结大。 结论rCFP10-ESAT6能诱导Mtb致敏豚鼠发生DTH，能特异区分Mtb致敏豚鼠及BCG免疫豚鼠，抗原剂量及反应时间是rCFP10—ESAT6诱导豚鼠DTH的主要影响因素。     

结核分支杆菌重组38KDa蛋白质抗原免疫学特性的研究

目的研究重组结核分支杆菌蛋白38KDa(rTPA38)的免疫学特性,以寻找特异性的诊断制剂。方法皮肤试验轮圈法:分别以HRV全菌体、卡介苗、堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏豚鼠备用;以5IU国际37标准品PPD为阳性对照,0.2μg重组rTPA38抗原分别于背部皮内注射48h观察红肿、硬结反应的纵横径。以rTPA为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中的特异性抗结核抗体。结果rTPA与PPD均可诱发豚3838鼠迟发型超敏反应(DTH),所产生的DTH反应与PPD相似,而对堪萨斯、偶发、瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠不产生DTH反应。238例肺结核病组、rTPA和PPD检测的灵敏度分别为65.1%、72.7%。健康献血员组、非结核38呼吸疾病组和卡介苗接种阳转者血清同时用rTPA和PPD检测,rTPA的特异性分别为95.6%、95.9%、383888.5%;PPD的特异性分别为91.8%、85.4%、68.7%。统计结果表明rTPA蛋白和PPD检测非结核呼吸疾病组,其38阳性率差异有显著性(P<0.05)。两者检测卡介苗接种阳转组的阳性率和血清抗体滴度差异有显著性(P<0.05)。结论rTPA38诱发豚鼠的DTH反应与PPD相似。rTPA蛋白抗原有较高的特异性和灵敏度,是ELISA法的38可靠抗原,可替代PPD成为一种新的特异性诊断制剂。     

重线结论分枝杆菌16000蛋白抗原（rPA16）豚鼠皮肤试验效果的研究

目的：以豚鼠为动物模型,分析重组１６０００蛋白抗原ｒＰＡ１６能否引起迟发型超敏反应（ＤＴＨ）。方法：连续３次皮下注射结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ热灭活菌体,使豚鼠致敏后进行皮肤试验。以生理盐水为阴性对照,ＰＰＤ为阳性对照组,重组蛋白则设置０．１,０．２,０．４μｇ三个剂量,分别进行背部皮内注射,注射后２４～７２ｈ观察豚鼠注射局部皮肤的皮痘、硬结程度。结果：０．１～０．４μｇ／０．２ｍｌ的重组蛋白抗原ｒＰＡ１６在４８～７２ｈ阳性反应平均直径与ＰＰＤ相比均无显著差异（均Ｐ〉０．１）,３种浓度的重组蛋白豚鼠皮肤反应的阳性率之间也无显著性差异（Ｐ〉０．１）。４８ｈ为ｒＰＡ１６引起豚鼠皮肤反应的较佳测量时间。结论：重组结核分枝杆菌１６０００蛋白抗原与ＰＰＤ相比,所引起的豚鼠皮肤ＤＴＨ的反应能力基本相似,具有皮肤试验的潜在应用价     

重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白皮肤试验与结核菌素皮肤试验的比较研究

目的比较重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白(重组11 kDa蛋白)皮肤试验与结核菌素皮肤试验(PPD)两种检测方法,探讨更适合结核分枝杆菌潜伏感染者的筛查方法。方法选取2015年9月北京市大兴区某大学新生共461名,进行重组11 kDa蛋白和PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 mL重组11 kDa蛋白(10μg/L)和0.1 mL结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)(50 U/mL),观察注射后72 h后皮肤反应。于皮肤试验前采集461名志愿者的静脉血,进行体外γ干扰素释放试验(T-SPOT.TB)检测,采用T-SPOT.TB试剂盒进行。比较重组11 kDa蛋白皮肤试验、结核菌素PPD皮肤试验的差异性。结果以注射72 h后的硬结反应进行统计,2种检测结果显示男女阳性率比较,差异无统计学意义。重组11 kDa蛋白皮肤试验中阳性反应者为17名,阳性率为3.68%;PPD皮肤试验中强阳性反应者为8名,强阳性率为1.74%。以T-SPOT检测结果为标准,重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为39.53%,100.00%,94.36%;PPD皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为16.28%,99.76%,91.97%。结论重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度高,与体外T-SPOT.TB检测结果一致且简便易行,有望成为结核分枝杆菌潜伏感染的新的筛查方法。     

重组结核分支杆菌16000蛋白抗原(rPA16)的免疫原性研究

目的：研究结核分枝杆菌重组16000蛋白（rPA16)诱发家兔产生抗体的能力并评价其血清学诊断的价值。方法：家兔按注射的抗原及佐剂的不同分组，皮下多点注射分别进行免疫，6次免疫后采血，双向琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）跟踪兔血清抗体效价的时间效应并检测兔血清与所试各类分支杆菌PPD有无交叉反应；同时检测rPA16与各分支杆菌PPD的免疫羊血清的反应，并用rPA16抗原检测人血标本，分析该抗原的临床检测的敏感性和特异性。结果：兔血清抗体效价结果显示：5个月后，加佐剂的抗原组的兔免疫血清仍能检测到抗体，不加佐剂组2个月后血清抗体检测即为阴性，ELISA检测兔免疫血清比双向琼脂扩散方法要更敏感，rPA16抗原加佐剂引起的兔血清抗体滴度最高可达1：6400，不加佐剂组的血清抗体滴度仅为1：400，ELISA法分析抗rPA16的兔血清的特异性表明其特异笥较好，仅与牛、人型结核分支杆菌的PPD呈阳性反应，与其他所试分支杆菌PPD反应均为阴性，同时又分析了rPA16抗原的特异性，与人型PPD相比，该抗原只与所试各类分支杆菌，BCG、牛分支杆菌免疫的血清呈阳性反应，而人型PPD则基本上与结核分支杆菌免疫的血清均呈阳性反应，ELISA检测血清标本结果：肺结核病组中rPA16和PPD检测敏感性分别为64.8%和75.2%；健康组，卡介苗接种阳转健康组，rPA16和PPD检测特异性分别为96.2%,88.5%和94.3%,66.7%。结论：rPA16具有较强的免疫原性和一定的特异性，可能成为结核病血清学诊断试剂之一。     

结核分枝杆菌38 kD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究

目的纯化获得结核分枝杆菌重组38kD蛋白，并评价其在血清学诊断方面的应用价值。方法应用亲和层析方法纯化结核分枝杆菌重组38kD蛋白，应用ELISA方法检测220例血清中的抗结核抗体。结果结核分枝杆菌重组38kD蛋白以包涵体形式表达，以48名正常人血清OD492＋2S为正常限值，57例PPD强阳性血清，47例菌阳结核病人血清和68例菌171结核病人血清阳性检出率分别为13．8％、97．87％和83．82％。结论结核分枝杆菌38kD重组蛋白以包涵体形式高效表达，具有较强的抗原特异性和免疫反应性。     

系统性光变态反应检测动物模型的建立

目的 建立稳定、完善的系统性光变态反应检测的动物模型.方法 以对氨基苯磺酰胺(SN)作为光敏剂,经腹腔注射与灌胃两种途径对小鼠和豚鼠进行给药,通过UVA加UVB光照诱导以及只用UVA光照激发后,于4 h、24 h、48 h和72 h分别测量小鼠耳厚度及观察豚鼠皮肤红斑反应.结果 24 h、48 h和72 h时,小鼠出现耳肿胀反应,豚鼠出现皮肤红斑反应.结论 口服、腹腔注射SN,均可产生光变态反应,成功建立系统性光变态反应检测的动物模型.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .     

结核分枝杆菌重组蛋白的制备及抗原性分析

目的:克隆表达结核分枝杆菌Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白,测定其抗原性和特异性. 方法:利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr 16×103和Mr 38×103抗原基因,经测序鉴定后克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性. 结果:携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为42%和18%;Mr 16×103和Mr 38×103蛋白量分别为:688 mg/L和217 mg/L. 其中Mr 16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为67.0%, 特异性为100%, 准确性为84.0%;Mr 38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为79.8%,特异性为99%,准确性为89.7%. 结论:以Mr 16×103,Mr 38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性,可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的克隆、表达及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌Mtb81抗原基因进行克隆、表达及纯化,并评价其抗原性。方法应用聚合酶链反应技术扩增结核分枝杆菌H37Rv Mtb81 DNA序列;将目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;经SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原Mtb81基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:35.8%、98.3%和56.7%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

107例颈淋巴结肿大者PPD试验结果分析

目的 :探讨结核菌素纯蛋白衍化物 (PPD)皮肤试验在颈淋巴结结核中的诊断价值及颈淋巴结结核病与年龄的关系。方法 :对 10 7例颈淋巴结肿大患者进行PPD试验 ,72h后观察反应 ,凡皮丘硬结≥ 10mm者和虽 <10mm而有水疱、淋巴管炎、溃疡者进行B超检查、淋巴结细针穿刺做病理学检查等。结果 :证明颈淋巴结肿大患者PPD试验阳性率在 80 %以上 ;经其他检查确诊为颈淋巴结结核病患者中 ,青少年组高于中年组、中年组高于老年组 ,均有显著差异 (χ2 =18.92 ,P <0 .0 1)。结论 :皮肤PPD试验为颈淋巴结结核的诊断提供了重要的科学依据 ,颈淋巴结肿大患者中颈淋巴结结核发病率较高 ,应引起临床医务人员的高度重视 ,尤其是对青少年患者 ,应早期进行相关检查 ,及时采取防治措施。     

仙鹤草水提液对食管癌Eca109细胞生长的抑制作用

目的:研究仙鹤草水提液对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用及其可能机制.方法:MTT法测定0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、16 g/L的仙鹤草水提液分别作用于Eca109细胞24 h、48 h、72 h,观察对Eca109细胞生长的抑制作用;采用免疫组织化学染色技术检测16 g/L仙鹤草水提液作用72 h对Eca109细胞Bcl-2、P53蛋白表达的影响.结果:MTT结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用48 h和72 h后Eca109细胞生长明显受抑;免疫组化结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用72 h后Eca109细胞内Bcl-2蛋白表达下调,P53蛋白表达上调.结论:仙鹤草水提液体外能诱导Eca109细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达及上调P53蛋白表达有关.     

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞的影响及其与Toll样受体-2的相关性

目的观察结核分枝杆菌MPT 64抗原对RAW264．7巨噬细胞凋亡及Toll样受体-2（toll-like receptor2,TLR-2）表达的影响。方法将佛波肉苴蔻醋酸（phorbol myristoyl acetate,PMA）分化的RAW264．7巨噬细胞分为阴性对照组、卡介菌纯蛋白衍化物（purified protein derivative of BCG, BCG-PPD）诱导组、PPD＋MPT64共同作用组,孵育16h后,AnnexinV-FITC染色,用流式细胞技术（flowcytometry,FCM）和Westernblot检测细胞凋亡、细胞膜及细胞内TLR-2的表达情况。结果BCG-PPD可以诱导RAW264．7巨噬细胞凋亡,PPD＋MPT64作用组的细胞凋亡水平明显低于BCG-PPD组,随着MPT64蛋白浓度的逐渐增高,凋亡水平逐渐降低。FCM和Western blot技术检测结果表明,BCG-PPD组的TLR-2表达水平明显高于阴性对照组,在诱导16h达到高峰。而在PPD＋MPT64组,细胞膜及细胞内的TLR-2水平均明显低于BCG-PPD组。结论MPT64抗原能够抑制PPD诱导的巨噬细胞凋亡,可能通过调节TLR-2的表达水平来实现。MtrI＇64抗原可能是一种毒力因子,在结核分枝杆菌感染机体的过程中,通过抑制巨噬细胞凋亡参与宿主与结核分枝杆菌的相互作用。     

重组人神经营养因子-4/5蛋白抗三氧化二砷神经毒作用

目的 :初步观察重组人神经营养因子 - 4/ 5 ( h NT- 4/ 5 )蛋白对三氧化二砷毒性的抑制作用。 方法 :利用 h NT- 4/ 5蛋白具有抗神经毒性的特点 ,采用本实验室克隆表达及部分纯化的具有天然 h NT- 4/ 5蛋白生物学活性的重组 h NT- 4/ 5蛋白 ,以不同水平的重组 h NT- 4/ 5蛋白 ( 0～ 10 0μl)与不同浓度的 As2 O3 ( 0～ 16 0μmol/ L )同时加入各组鸡胚前脑神经细胞和 PC12细胞培养液中共同孵育 2 4～ 48小时 ,观察其对染毒鸡胚前脑神经细胞存活和 PC12细胞突起生长的影响作用。 结果 :在鸡胚前脑神经细胞和 PC12细胞中与 As2 O3 共同培养 48小时后 ,对照组与实验组的细胞存活率差异有显著性 ,而且细胞存活率和突起数目随 h NT- 4/ 5浓度增高而提高和增加。 结论 :初步观察到重组 h NT- 4/ 5蛋白具有抑制 As2 O3 的毒性作用 ,为从基因工程途径寻找抗环境毒物因子提供了依据。     

结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用

以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法最佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).     

烧烫灵软膏皮肤用药的急性毒性研究

目的 :研究烧烫灵软膏皮肤外用的急性毒性反应。方法 :将 1.0∶ 0 .5 (1.0 g软膏相当于生药 0 .5 g)及 1.0∶ 2 .0 (1.0 g软膏相当于生药 2 .0 g)的烧烫灵软膏分别涂于家兔完整及破损皮肤的脱毛区 2 4 h,去除受试物后 1h、2 4h、4 8h、72 h至第 7日进行观察 ,与对照组比较。结果 :给烧烫灵软膏组动物的体重、皮肤、眼、黏膜、呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等均无明显变化。结论 :结果表明 ,1.0∶ 0 .5 ;及 1.0∶ 2 .0浓度的烧烫灵软膏外用于家兔完整或破损皮肤 ,均未引起毒性反应     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.