多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

新型阳离子脂质体的制备及其转染效率的测定

目的制备以新型细胞转染素为阳性成分的阳离子脂质体,作为基因载体,用于基因转染的实验研究和肺部疾病的基因治疗.方法用薄膜法制备N4-精胺胆固醇羰酰氨阳离子脂质体,通过电镜观察和电泳,检测其形态、结构和细胞转染条件,并对SPC肿瘤细胞进行转染,评估其转染效率.结果制备的新型阳离子脂质体具有良好的微囊形态,当脂质体∶质粒为(6～8)∶1时,其转染效率可达60%.结论成功制备了新型阳离子脂质体,在适当条件下其具有较高的转染活性,为以后的基因转染和基因治疗打下基础.     

阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

Lipofectamine^TM 2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠耳蜗成纤维细胞的实验研究

目的检测真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。方法培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞，用阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导的方法，将含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP．NT3对其进行转染，转染后24h，通过Confocal显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况。结果通过阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导，真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3能有效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体plRES2-EGFP-NT3在阳离子脂质体介导下对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的有效转染为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

大豆甾醇糖苷及两亲性聚乙二醇对阳离子脂质体细胞转染与膜各向异性的影响

目的：考察不同脂质体材料对阳离子脂质体细胞转染率和脂质体膜流动性的影响。方站：合成美国FDA认可应用于人体给药的阳离子材料3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(3β[N-(N’，N’-dimethy-laminoethane)carbamoyl]cholesterl，DC-chol)；以荧光素钠(fluorescein sodium，SF)为荧光标记物，二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmibylphosphatidylcholine，DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)和胆固醇(cholesterol，ch)为辅佐膜材，分别制备DPPC／ch／DC-chol阳离子脂质体、DOPE/ch／DC-chol阳离子脂质体及大豆甾醇糖苷(soybean-derlved sterylglucoside，SG)或聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethylene glycol-dis-tearoylphosphatidylethanolamine，PEG-DSPE)表面修饰的阳离子脂质体，并制备DPPC/ch组成的中性脂质体。以HepG2 2．2．15为细胞模型观察不同脂质体处方对细胞转染率的影响；通过荧光偏振法考察不同脂质材料对脂质体膜流动性的影响。结果：DC-chol能显著增加脂质体对SF的包封率(从0．64％到的74．84％)、细胞转染率(从1．83％到32．29％)及脂质体膜的流动性。在阳离子脂质体处方中加入SG能显著提高阳离子脂质体的包封率(从52．60％到63．37％)、细胞转染率(从20．18％到47．48％)及脂质体膜的流动性；PEG-DSPE可促进阳离子脂质体的细胞转染(从20．18％到28．17％)。结论：DC-chol和SG能显著提高脂质体的细胞转染率和脂质体膜的流动性；PEG-DSPE能促进阳离子脂质体的细胞转染。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

外源基因转染血管内皮细胞条件优化

目的探讨阳离子脂质体及电穿孔法介导外源基因转染血管内皮细胞的转染效率并进行条件优化。方法采用绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体为载体以及电穿孔方法,转染人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）。培养48 h后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在HUVEC内的表达及转染效率。结果 Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体介导组有少量细胞可见弱荧光信号,而电穿孔法转染组可见较强荧光信号,其中以电击条件为电场强度1100 V、脉冲时间20 ms、电击2次的转染效率最好。结论电穿孔法介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,可作为血管内皮细胞的外源基因转染的方法。     

阳离子脂质体介导β干扰素基因转染对人胶质瘤细胞的抑制作用

目的:建立阳离子脂质体载体,介导β干扰素(IFN-β)基因转染人胶质瘤细胞系,观察其生长抑制作用.方法:以反相蒸发法制备含IFN-β的阳离子脂质体载体,转染SK-MG-1胶质瘤细胞系.MTT法观察其生长抑制情况,流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果:阳离子脂质体介导IFN-β基因转染可抑制SK-MG-1细胞的生长,抑制作用强于IFN-β蛋白.IFN-β蛋白和基因转染可以诱发SK-MG-1细胞的凋亡.结论:阳离子脂质体可作为一种有效的载体应用于胶质瘤的基因治疗中.IFN-β可抑制胶质瘤细胞系SK-MG-1的生长,诱发凋亡.     

阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较

目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.     

寡核苷酸转染原代培养pMφ的研究

目的研究阳离子脂质体为载体的寡核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs)转染原代培养的大鼠腹腔巨噬细胞(pMφ)的时相关系、分布以及转染效率。方法以阳离子脂质体为载体,将荧光标记的圈套ODNs(2.0μg/ml)转染入纯化的大鼠pMφ细胞,分别在30 min、1 h,3 h,6 h,9 h,12 h,18 h,24 h用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察荧光标记的圈套ODNs在细胞内的动态变化。结果荧光显微镜下转染30 min细胞内便有荧光标记的圈套ODNs出现,转染6~12 h细胞内的荧光最强。激光共聚焦显微镜显示转染30min细胞内荧光标记的圈套ODNs主要分布在胞浆内,随着时间的延长,细胞内尤其胞核内的荧光越来越强,转染6~12h细胞内的荧光最强。Results:结论以阳离子脂质体为载体的哑铃形圈套ODNs可转染入大鼠pMφ细胞并分布于胞浆及胞核。     

肺癌移植瘤不同转染方法在体转染效率的实验研究

目的探讨在体肺移植肿瘤的转染方法和转染效率。方法采用电脉冲法和阳离子脂质体两种不同转染方法在体转染绿色荧光报告基因至裸鼠肺移植瘤,观察不同转染方法的转染效率。结果脂质体组转染效率为0.64±0.06(x±s),电脉冲组为0.80±0.11(x±s),两组相比有统计学意义(P<0.05)。结论对于在体肿瘤的转染,电脉冲法为一种较好的转染方法。     

两种方法制备阳离子脂质体包裹蛋白转染法的比较

目的　比较不同方法制备包裹蛋白脂质体的包封率和转染率 ,评价蛋白转染的可行性。方法　采用逆相蒸发法和冻融超声法制备包裹人IgG的阳离子脂质体 ,测定包封率并分别转染小鼠脾细胞 ,用流式细胞术、免疫荧光法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法和免疫印迹法检测转染效果。结果　逆相蒸发法制备的脂质体包封率高于冻融超声法 (P <0 .0 1)。两种方法制备的脂质体转染率无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　逆相蒸发法制备的阳离子脂质体更适合作为蛋白转染的载体有效地将目的蛋白导入细胞     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。     

脂质体介导寡脱氧核糖核苷酸转染人视网膜色素上皮细胞的转染率及分布测定

目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000 介导的寡脱氧核糖核苷酸(ODNs)在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的转染效率及其在细胞中的分布.方法:在阳离子脂质体LipofectamineTM 2000的介导下将人工合成的FAM荧光标记的ODNs转入人RPE细胞中,荧光显微镜下观察转染后20 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h其在细胞内的分布,流式细胞仪检测其在RPE细胞中的转染效率;并用MTT法检测脂质体处理组、脂质体-ODNs复合物处理组和正常对照组的细胞增生活性,观察脂质体的毒性.结果:LipofectamineTM 2000能迅速将FAM-ODNs转入人RPE细胞的胞质和胞核内,4～6 h达高峰,转染效率高达(85.85±5.75)%,与其他时点比较差异有统计学意义(P<0.05),24 h后其转染率还有(70.11±5.81)%;且脂质体对RPE细胞无明显细胞毒性,3组间细胞增生活性比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:LipofectamineTM 2000能有效地将FAM-ODNs转入人RPE细胞中,可作为一种安全有效的基因转移载体用于基因治疗.