登革热的抗体依赖性感染增强的体外实验研究

目的建立异型登革热病毒(DENV)感染所产生的抗体依赖感染增强作用(ADE)的体外实验研究模型。方法将梯度稀释的抗-Ⅱ型登革热膜前蛋白prM单克隆抗体与Ⅲ型登革热病毒(MOI=3)于37℃、5%CO2培养箱内孵育90min形成抗体-病毒复合物后感染K562细胞,通过间接免疫荧光染色,real-time PCR检测DENV抗原在细胞内的表达增强。结果抗体依赖增强作用(ADE)的效果取决于抗体浓度。稀释度为1/2560的抗体与DENV结合共同感染K562后,细胞内登革热病毒抗原的免疫荧光染色结果有明显增强,real-time PCR检测的结果也进一步证实了K562细胞内登革热病毒数量显著增加。结论成功建立了登革热病毒的异型抗体依赖感染增强作用的体外研究模拟,为后续的ADE作用机制的研究提供了可靠的研究模型和实验基础。     

登革病毒2型prM蛋白的表达及其抗体的ADE作用研究

目的建立登革病毒2型（DENV-2）前膜蛋白（prM）的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用（ADE）。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2prM蛋白,经电洗脱法纯化重组蛋白,免疫家兔,制备兔抗prM蛋白多抗;应用空斑减数中和试验（PRNT）和流式细胞术（FCM）分别检测prM兔多克隆抗体的中和作用和ADE效应。结果重组prM蛋白在原核系统可获得高效表达,prM蛋白的表达量占大肠杆菌全菌蛋白的15％左右;其免疫血清经Westernblotting法证实为登革病毒特异性prM多克隆抗体,用ELISA法检测效价为1：800000。PRNT表明,prM抗体对成熟和不成熟DENV．2感染C6／36细胞中和作用有限,最大中和程度分别为49．84％和50．22％;FCM结果表明,prM抗体能在较大的抗体稀释度范围（10-2～10-6）增强成熟和不成熟DENV-2感染,且在10。稀释度时达到最高峰。结论重组DENV-2prM蛋白有很强的免疫原性．其诱生的prM抗体对登革病毒仅有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE作用,揭示prM抗体是一种感染增强性抗体。     

prM抗体在登革抗体依赖增强作用中的研究进展

登革病毒感染在热带和亚热带地区是一种常见的病毒性疾病,主要通过虫蚊叮咬感染人类。登革病毒分为四个亚型,异型二次感染时引起登革出血热和登革休克,抗体依赖增强作用在体内外已被证实是登革二次感染导致严重病症的主要机制。prM抗体具有潜在的抗体依赖增强作用活性和低中和能力。本文主要讨论prM抗体在登革病毒抗体依赖增强作用中的研究进展。     

1型登革病毒初次感染患者血清中和抗体的动态反应分析

目的研究感染登革病毒（DENV）后,机体DENV中和抗体产生的特点及其动态变化规律。方法采集2006年DENV-1初
次感染患者在发病2周之内的,以及同一组患者在2010年随诊期间的血清标本,用本实验室建立的以群特异性DENV NS1抗原
捕获ELISA为基础的,可同时测定4型DENV中和抗体的微中和试验（ELISA-MNT）,对这两组血清中的DENV中和抗体滴度
进行检测。这两组血清标本均检测了全部抗4型DENV的中和抗体。此外,2010年的血清标本还检测了抗3种不同毒株的
DENV-1（其中包括1株标准株和2株临床分离株）的中和抗体。结果2006年和2010年这两组不同时间段的血清标本对全部4
型DENV均可显示出一定程度的交叉中和抗体反应,其中,2006年的血清标本交叉中和抗体反应更为明显,表现为其最高的中
和抗体针对的甚至是DENV-2,而不是预计中的DENV-1;2010年的血清标本中最高的中和抗体滴度针对的是同型的
DENV-1。Mann-whitney U检验显示：对于同型的抗DENV-1中和抗体滴度,2010年的血清要明显高于2006年的血清（U=
86.500,P=0.000）,但异型中和抗体滴度在两组血清标本中无明显改变。Friedman检验显示,尽管同属DENV-1,但2010年的血
清标本对3种不同毒株的DENV-1的中和抗体滴度之间还是存在显著差异（χ2=12.123,P=0.002）。结论4型交叉中和抗体反应
是DENV感染后,尤其是在感染早期中和抗体的产生特点,但只有同型DENV中和抗体滴度可随时间的推移而发生明显的上
升;然而即使是同属于一种血清型,不同毒株之间的中和抗体也可能存在差异。
     

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒,明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力。方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6／36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E／NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N—J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力。结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构。RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E／NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1／GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN—1／T14株(澳大利亚,1981)同源性最高,达98％。N—J法构建进化树显示：11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse1990分型中的Ⅰ,Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P．Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美N／tbN型相符,本室分离的DEN-1／GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN-1／GZ2002株脑内接种乳鼠11d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡。感染Vero细胞8d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达10^6pfu／ml,TCID50为4．37log pfu／0．2ml。结论2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱。     

喜炎平注射液抗Ⅱ型登革病毒作用的体内及体外实验研究

目的 分别通过体外和体内实验研究喜炎平注射液对Ⅱ型登革病毒（Dengue virus serotype 2, DENV2）的抗病毒作用。方法 体外实验以利巴韦林注射液作为阳性对照药物,分别以灭活、抑制进入、治疗性给药以及预防联合维持治疗的方式处理人肝癌细胞株HepG2细胞,在不同时相点收获上清和细胞,分别利用间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测DENV2的病毒载量,从而评价喜炎平注射液的体外抗DENV2作用。体内实验以SCID小鼠为实验鼠,腹腔注射HepG2细胞,建立模型小鼠,腹腔注射感染DENV2,次日给予不同剂量（1、2、4 mg/只）的喜炎平注射液,连续给药4 d,部分小鼠于感染第6日取材,利用IFA检测实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并观察实验鼠的生存率。结果 体外实验显示,喜炎平注射液能够灭活DENV2,并抑制DENV2进入细胞,同时无论是治疗还是治疗联合预防给药,均可对DENV2的复制具有良好的抑制作用,即在病毒感染早期及晚期,喜炎平均可发挥抗病毒作用,且优于利巴韦林。进一步在体内实验中同样显示喜炎平具有较好的抗病毒作用,可以降低实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并可提高实验鼠的生存率。结论 喜炎平注射液具有明显的抗DENV2病毒的作用,可为DENV感染的治疗提供新的候选药物。     

Ⅰ~Ⅳ登革病毒基因同源性分析及Ⅱ型C蛋白二级结构预测

目的 对登革病毒（dengue virus,DENV）Ⅰ~Ⅳ基因同源性进行分析,同时对DENV Ⅱ C蛋白的二级结构进行预测,为更深入了解DENV 4个血清型间差异及衣壳蛋白C构想。方法 通过DNAMAN分子生物学分析软件和蛋白结构在线预测网站分别对登革病毒基因同源性及C蛋白的二级结构进行预测。结果 在登革病毒基因组同源性中,DENVⅠ与Ⅲ同源性最高为72%,发现DENVⅠ与Ⅳ同源性最低为67%;在登革病毒基因中,前膜基因prM的的同源性最高为82.5%,非结构基因NS2a的同源性最低为55.28%。在编码capsid的氨基酸中,占组成比例最多的为是精氨酸,可能存在的蛋白结合位点较多。结论 通过基因组同源分析图谱看出Ⅰ~Ⅳ DENV在结构基因（C、prM、E）之间和非结构基因NS1,NS2b和NS3中的同源性较高,同时蛋白二级结构预测发现DENV ⅡC蛋白可能具有分子识别和蛋白骨架等功能。     

携带荧光素酶登革亚病毒颗粒的构建和鉴定

目的 拟将荧光素酶基因整合入登革病毒（DENV）亚病毒颗粒（RSPs）中,构建能用于抗体介导的感染增强（ADE）高通量筛选的研究工具。方法 将荧光素酶基因luciferase插入DENV包膜蛋白基因prME的3'端,取代prME第二个跨膜区,构建prME-luc融合基因。用prME-luc融合基因转染293T细胞,在上清中检测携带荧光素酶的登革亚病毒颗粒（RSP-luc）。结果 转染prME-luc的293T细胞可以将RSP-luc释放至培养上清中,共转染野生型prME能够提高RSP-luc的产量。Western-blot技术确认了RSP-luc中含有DENV包膜蛋白和荧光素酶形成的融合蛋白。RSP-luc易于制备并可通过超速离心分离纯化,且可通过测定荧光素酶活性快速定量。体外实验显示RSP-luc能够与Vero细胞、U937细胞以及小鼠腹腔巨噬细胞等DENV靶细胞结合,结合过程可被受体类似物硫酸肝素竞争性抑制,也可被DENV特异性抗体4E11增强。结论 RSP-luc 能够模拟DENV 感染过程,有望成为深入研究DENV 与宿主相互作用及ADE 发生机制的有效工具。     

登革病毒感染人原代树突状细胞(CD209,-139A/-336A)模型的建立

目的 建立以人原代树突状细胞(dendritic cells,DCs)为宿主的登革病毒(dengue virus,DENV)感染模型.方法 采集基因型为CD209,-139A/-336A的人抗凝血标本,分离获得DCs前体细胞,利用rhGM-CSF及rhIL-4诱导,获得未成熟DCs.瑞氏染色鉴定DCs的形态,流式细胞术鉴定DCs的分化效率,淋巴细胞增殖实验鉴定DCs的生物学功能.以Ⅰ型登革病毒GZ2002株为模式病毒进行病毒感染实验,建立并评估以人原代DCs为宿主的登革病毒感染模型.结果 分离获得的DCs前体细胞经细胞因子刺激后成功分化为未成熟DCs,分化效率高达90％.获得的DCs具有典型的细胞形态及生物学功能,可有效刺激淋巴细胞增殖.登革病毒GZ2002株能成功感染诱导获得的原代DCs,促进DCs成熟,并复制产生感染性子代病毒,证明细胞感染模型成功建立.结论 成功建立以DCs为宿主的登革病毒感染模型.     

河南省1例柬埔寨输入登革热病例的病原分子分型与全基因序列分析

目的鉴定河南省1例来自柬埔寨的登革热输入性病例的登革病毒(dengue virus,DENV)血清型和基因型及其序列特征和传播来源。方法患者血液标本来源于2019年国家疾病监测系统网络直报的登革热疑似病例。样品经快速检测DENV NS1抗原和IgM/IgG抗体,再提取血清中核酸,应用荧光RT-PCR法进行DENV血清型鉴定,同时用Vero和BHK-21细胞对血清标本进行病毒分离培养,阳性培养物扩增全基因组序列,进行序列系统进化分析。结果该病例实验室确诊为DENV 1型感染,并从血清标本中分离到病毒株,测序后拼接成全长10670 nt的全基因组序列,经系统进化分析,该病毒株属于DENV 1型基因Ⅰ型,与东南亚流行株具有较高同源性和较近亲缘关系。结论2019年河南省来自柬埔寨的输入性病例的病原体为DENV 1型基因I型,此为近年来东南亚输入我国的常见血清型和基因型。     

中国流行性出血热病毒的抗原性研究——不同毒株间交叉免疫荧光和交叉中和试验

用不同来源EHF病毒毒株免疫家兔制备相应的抗血清,对各株病毒进行交叉免疫荧光测定和交叉中和试验,结果显示交叉免疫荧光法难以对我国不同来源病毒抗原性差异作出型别判断。交叉中和试验,根据同株与异株中和抗体滴度相差4倍的判断标准,可将病毒分为三个不同的类型:Ⅰ型(野鼠型):Chen、A_(96)、A_3及汉坦76-118;Ⅱ型(家鼠型):R_(22);Ⅲ型(中间型):H_(8205)、L_(99)。Ⅰ型抗体对Ⅱ型(R_(22))病毒与Ⅰ型病毒有相同的中和效力。反之,R_(22)(Ⅱ型)抗体对Ⅰ型病毒的中和滴度则低于同型的4倍;Ⅲ型L_(99)株兼有部份Ⅰ型及Ⅱ型病毒相同水平的中和抗体滴度,而H_(8205)株又缺乏Ⅱ型及Ⅰ型中另一些毒株有效中和能力。     

登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用

目的构建含有登革Ⅱ型病毒（DENV-2）前膜蛋白（prM）基因反向重复序列（irRNA）的重组质粒,评价其抑制病毒复制的
效果。方法DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ的识别位点,将经RT-PCR 扩增
的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引
入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR 扩增prM 全长基因片段插入pMD18-T-vector 中,形成含有正向序列的重组质粒
pMD18-T-prM。限制性内切酶NheⅠ和KpnⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线
性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA
用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构
建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量
PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28%;实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒
拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组（P<0.05）。结论DENV-2 prM反向重复
序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
     

血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测结果的影响

目的 比较6种不同血清对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度（CCID₅₀）检测结果的影响。方法 分别采用6种未处理血清和6种预处理血清组（免疫吸附法）进行Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测（微细胞病变法）,检测了不同组血清中Ⅱ型脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,并使用处理血清组进行促细胞生长试验。最后分析不同血清对感染性滴度的影响。结果 6种未处理血清组病毒感染性滴度检测结果差异有统计学意义（P<0.01）,6种处理血清组病毒感染性滴度差异无统计学意义（P>0.05）。未处理组2号血清的中和抗体滴度为1：4,6号血清的中和抗体滴度为1：8,其余各组血清的中和抗体滴度均<1：4。6种处理血清组的中和抗体滴度均为1：2。血清促细胞生长试验显示6种处理组血清细胞生长趋势正常。结论 Ⅱ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度检测前使用免疫吸附对血清进行预处理,可降低血清中存在的中和抗体对检测的影响,为比较不同实验室数据提供可能。     

宿主蛋白LSm1-7复合体在登革病毒RNA复制中的作用研究

目的 探讨LSm1-7复合体在登革病毒(DENV)RNA复制中的作用.方法 DENV感染HepG2细胞后,在不同时间点(2、24、36、48 h)收集细胞和提取总mRNA,实时定量PCR (RT-qPCR)分析LSm1表达水平;将LSm1的siRNA和非特异对照siRNA两次转染HepG2细胞后感染DENV-2,24h后收集细胞,提取总mRNA,RT-qPCR分析LSm1表达水平与病毒RNA表达水平;利用LSm1抗体与dsRNA抗体对DENV感染细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦分析LSm1与dsRNA共定位情况.结果 与2h比较,随着时间的推移,DENV-2 RNA和LSm1 RNA水平逐渐升高;与对照组siNC比较,siLSm1组LSm1 RNA水平明显降低,沉默效率达78.2％;与对照组siNC比较,siLSm1组DENV RNA含量降低35.6％;LSm1-7复合体在DENV感染HepG2细胞后募集到核周围,与DENV dsRNA共定位.结论 LSm1-7复合体可能作为DENV复制复合物的组成部分,正调控DENV RNA的复制.     

2014-2019年揭阳市登革病毒E基因序列分析

目的探讨揭阳市登革病毒(DENV)的分子特征并进行生物学溯源。方法收集2014-2019年揭阳市登革热流行期间登革热疑似和临床诊断病例的急性期血清,用实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核酸及分型,阳性标本进行病毒分离及鉴定,扩增并测定部分分离株E基因序列,用生物学软件进行序列比对分析并构建系统进化树。结果 896份急性期血清中DENV核酸阳性556份,阳性率为62.05%;血清型以DENV-Ⅰ为主(534例,占96.04%),其次为DENV-Ⅱ(18例,占3.24%)。序列分析显示,DENV-Ⅰ分离株基因型分属Ⅰ型和Ⅴ型,以Ⅰ型为主;DENV-Ⅱ分离株基因型均属于Cosmopolitan型。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株与周边地市、珠三角城市及东南亚国家流行株同源性较高。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株均属于弱毒株。结论 2014-2019年揭阳市登革病毒以血清Ⅰ型基因Ⅰ型为主,其次是血清Ⅱ型基因Cosmopolitan型;推测揭阳市登革热流行毒株多来源于周边地市、珠三角城市及东南亚国家。     

宿主蛋白LSml-7复合体在登革病毒RNA复制中的作用研究

目的探讨LSml-7复合体在登革病毒（DENV）RNA复制中的作用。方法DENV感染HepG2细胞后．在不同时间点（2、24、36、48h）收集细胞和提取总mRNA,实时定量PCR（RT-qPCR）分析LSml表达水平;将LSml的siRNA和非特异对照siRNA两次转染HepG2细胞后感染DENV-2,24h后收集细胞,提取总mRNA,RT-qPCR分析LSml表达水平与病毒RNA表达水平;利用LSml抗体与dsRNA抗体对DENV感染细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦分析LSml与dsRNA共定位情况。结果与2h比较,随着时间的推移,DENV-2RNA和LSmlRNA水平逐渐升高;与对照组siNC比较,siLSml组LSmlRNA水平明显降低,沉默效率达78．2％;与对照组siNC比较,siLSml组DENVRNA含量降低35．6％：LSml-7复合体在DENV感染HepG2细胞后募集到核周围,与DENVdsRNA共定位。结论LSml-7复合体可能作为DENV复制复合物的组成部分,正调控DENVRNA的复制。     

甘草甜素对HSV-1抑制作用的实验研究

目的:观察甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,为临床更为有效的治疗单纯疱疹病毒性脑炎探索新的药物.方法:体外培养Vero细胞,分成甘草甜素在病毒吸附vero细胞后加入病毒、吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,通过观察空斑形成单位来评价甘草甜素对单纯疱疹病毒Ⅰ型的抑制作用,以及作用发生于病毒感染的哪个阶段.结果:病毒吸附vero细胞后加入甘草甜素能明显抑制病毒所致的空斑形成,IC50为0.56mmol/L.吸附前甘草甜素预处理细胞以及吸附前甘草甜素预处理病毒,对病毒所致的空斑形成无明显影响.结论:甘草甜素能明显地抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型的复制,它的作用是发生在病毒穿入细胞后的阶段,不能阻止病毒对细胞的吸附,也不能直接灭活病毒.     

微管骨架在登革病毒感染ECV304细胞中作用的初步研究

目的研究登革病毒在与ECV304细胞相互作用过程中细胞微管骨架的变化,以及微管在病毒释放过程中的作用.方法用2型登革病毒感染ECV304细胞株,间接免疫荧光双染色技术观察微管和病毒抗原的分布;应用colcemid破坏微管骨架,检测细胞内外病毒滴度的变化,以明确微管是否参与病毒的复制.结果登革病毒感染后ECV304细胞微管骨架的排列发生明显的变化,表现为3种类型:无序排列;围绕核形成环状结构;微管结成束状形成线状突触.间接免疫荧光双染色结果显示登革病毒抗原与微管共染,分布在微管组织中心.感染后8 h,药物组上清中的病毒滴度高于一般感染组,而细胞内的病毒滴度低于一般感染组.结论登革病毒感染引起ECV304细胞微管的排列发生变化,可能是病毒感染造成了微管解聚,后者促进病毒的释放;药物的添加,加剧了对微管的破坏程度,从而进一步促进了病毒的释放.     

噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒检测中的应用

目的:探讨噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒滴度检测中的应用。方法:用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂进行空斑形成实验MDCK和Hep-2细胞在12孔板上形成单层后,分别感染流感病毒和呼吸道合胞病毒,加入单层琼脂糖代替传统双层琼脂糖培养3-4天,用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂计数空斑。结果:⑴MTT法空斑形成实验检测流感病毒和RSV病毒滴度操作简单,时间短;⑵与常规中性红法空斑形成实验比较检测病毒滴度没有差异;⑶MTT法可以避免假空斑形成。结论:MTT法空斑形成实验可替代中性红法空斑形成实验,且更快速、准确。     

大黄提取液体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用的实验研究

目的:研究大黄提取液在体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)的作用。方法:用hela细胞做体外培养实验,以不同剂量的大黄提取液作用于病毒复制周期的各个阶段,以病毒半数感染量(TCID50)、细胞病变(CPE)、MTT染色细胞保护率(MTT法)作为评价指标,判断药效,对大黄提取液抗HSV-Ⅱ作用进行评价。结果:大黄提取液对hela细胞的增殖无明显作用,且对hela细胞毒性极低,对病毒有直接灭活作用;可干扰病毒向宿主细胞吸附,还可有效抑制病毒复制。结论:大黄提取液在体外对HSV-Ⅱ有显著的抑制和杀伤作用,并且有效抑制病毒复制。