穿孔素和颗粒酶B在急性期登革病毒患者体内的表达水平及调控机制初探

目的 登革病毒(Dengue virus,DENV)感染引起的登革热和登革出血热已给世界带来极大危害,明确其感染引起的免疫病理损伤机制尤为关键。方法 以DENV感染急性期患者样本为研究对象,抽取静脉血,利用密度梯度法提取外周单个核细胞（PBMCs）,流式细胞术检测PBMCs各亚群表达穿孔素和颗粒酶B的水平,进而探讨DENV急性期患者T细胞亚群和NK细胞亚群免疫功能的差异。结果 DENV患者CD8⁺T细胞和NK细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达水平发生显著上调,细胞脱颗粒水平也显著增加;同时表达穿孔素或颗粒酶B的NK细胞比例显著高于CD8⁺T细胞。另外,本研究还发现三个重要miRNAs （miR-27a*、miR-30e和miR-378）在DENV患者体内的表达量明显降低,已有的研究表明其可能靶向调控穿孔素或/和颗粒酶B的表达。结论 DENV感染可诱导CD8⁺T细胞和NK细胞发挥效应功能,并依赖穿孔素和颗粒酶途径杀伤被病毒感染的靶细胞;DENV患者体内PRF1和GrzB的表达很可能受到miR-27a*、miR-30e和miR-378的靶向调控。通过上述研究为阐明T细胞和NK细胞在DENV感染过程中所发挥的免疫效应功能提供更多的理论基础。     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

慢病毒的超滤浓缩及细胞感染效应

目的 构建pLVX-CD63-mNeptune-Puro重组质粒,使用HEK293T细胞包装慢病毒,探讨慢病毒经超滤浓缩后的纯化效果极其对MGC-803细胞的转染效应。方法 使用重叠PCR方法构建CD63-mNeptune融合基因,并插入pLVX-Puro载体构建转移质粒。转移质粒、包装质粒和外膜蛋白质粒共转染HEK293T细胞包装慢病毒颗粒。收集转染后48 h及72 h细胞培养液,4 ℃下2 500 ×g离心10 min去除细胞沉淀和碎片,上清液通过0.45 μm PVDF Millex-HV滤器过滤,收集滤液于15 mL离心管。取1 mL滤液于1.5 mL EP管,余下滤液用截留分子量100 000超滤管进行浓缩。使用P24检测试剂盒检测浓缩前后细胞培养液中病毒颗粒数。分别使用未浓缩慢病毒液与超滤浓缩慢病毒液感染MGC-803细胞。通过观察MGC-803细胞荧光信号来比较慢病毒的感染率。结果 成功构建慢病毒转移质粒并使用HEK293T细胞包装出慢病毒颗粒,细胞上清液中的慢病毒颗粒数经超滤浓缩后浓度提高了264倍,使用超滤浓缩的慢病毒液感染细胞后,荧光显微镜观察到携带荧光信号的活细胞多于未浓缩慢病毒液。结论 超滤浓缩可以提高慢病毒颗粒浓度,并提高细胞感染率。采用超滤浓缩慢病毒的方法适合大多数普通实验室操作。     

新法制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌,制备BJ5183pAdEasy-1细菌;再以后者作感受态细菌,与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,转染293细胞,制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60%(6/10)。转染293细胞后7~12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行,重组效率较高,易于推广应用。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

登革病毒IgG抗体的检测:基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）,用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义（P>0.05）;阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义（P>0.05）;重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。     

具有广谱中和活性的HIV感染者血浆病毒膜蛋白基因及中和特征分析

目的 分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白（Env）基因序列特征及中和特征。方法 使用单拷贝基因组扩增（SGA）方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因克隆至pcDNA^TM3.1载体上,env质粒和骨架质粒pSG3△env共转染293T细胞制备假病毒,使用假病毒分别和两个时间点的自体血浆及6种不同的广谱中和抗体进行中和试验,分析Env蛋白的中和特征。结果 从两个时间点血浆样本中共获得50个全长env基因,进化分析显示两个时间点序列各自聚集成簇,第1个时间点膜蛋白序列有较短的V1区和较少的V1区糖基化位点数目,第2个时间点膜蛋白序列有更高的基因多样性。自体血浆不能中和同时期的假病毒,但能中和前期的假病毒;两个时间点的假病毒对PGT121、PGT135、2G12和10E8抗体均高度敏感,但对VRC01及12A21抗体呈现中和抗性。结论 该具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白基因持续进化;感染者体内存在CD4bs类中和抗体的免疫压力。     

人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

自助采样传递检测HIV抗体模式应用研究

目的 探索新的艾滋病病毒（human immunodeficiency virus,HIV）抗体检测模式,为提高检测主动性、更大范围促进HIV抗体传递检测提供可推广的经验。方法 以专用尿液采集管、干血斑滤纸片作为传递载体,分别采集尿液和干血斑,依靠物流或志愿者传送采集样本到专业实验室。分别针对尿液HIV-1/2抗体和干血斑HIV-1/2抗体的诊断试剂盒（酶联免疫法）检测,检测结果上传至网站,求询者通过序列码在移动终端查询结果和咨询。结果 暗娼人群中回收干血斑和尿液各293人份,回收率97.67%,干血斑、尿液检测结果与确证结果的一致率分别为98.98%（290/293）和98.29%（289/293）;男男性行为人群（men have sex with men,MSM）中回收检测包1 595人份,回收率63.8%,干血斑传递检测HIV结果与快速自检结果的一致率为99.81%（1 586/1 589）;大学生人群中回收尿液样本180份,阳性检出率为4.4%。通过分析网络查询结果记录,男男性行为人群平均查询次数为1.2次,最高查询次数为26次;大学生平均查询次数为3.5次,最高查询次数为46次。结论 尿液和干血斑采集可以作为HIV抗体检测的样本,并且传递检测可作为一种新模式推广应用。     

双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的调控作用

目的 验证hsa-miR-1291对ARHGAP29基因的靶向调控作用。方法 利用PCR方法,根据目的基因ARHGAP29的3'非编码区(3' untranslated region,3'UTR)序列信息设计扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板,扩增ARHGAP29基因的野生型3'UTR片段(ARHGAP29-WT 3'UTR)及突变型3'UTR片段(ARHGAP29-MUT 3'UTR),并将其分别克隆到双荧光素酶报告pmiR-RB-Report载体中,构建双荧光素酶基因报告载体,即野生型载体ARHGAP29-WT 3'UTR pmiR-RB-Report和突变型载体ARHGAP29-MUT 3'UTR pmiR-RB-Report。将hsa-miR-1291 mimic、阴性对照(non-target control,NC组)同野生型载体、突变型载体载体分别共转染于293T细胞中,进一步检测相对荧光值。结果 成功构建ARHGAP29-WT 3'UTR pmiR-RB-Report载体(野生型载体)、ARHGAP29- MUT 3'UTR pmiR-RB-Report载体(突变型载体)。荧光检测结果显示,野生型载体转染hsa-miR-1291 mimic后,其荧光表达较NC组明显下降(0.67±0.04 vs 1.00±0.08, P=0.014);转染hsa-miR-1291 mimic后,突变型载体的荧光表达相对于野生型载体的荧光表达有所上升(1.20±0.05 vs 0.67±0.04, P<0.001)。结论 初步证实hsa-miR-1291很可能对ARHGAP29 3'UTR上的该位点有靶向调控作用。     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

利用绿色荧光蛋白进行microRNAs靶点分析的研究

目的利用绿色荧光蛋白作为报告基因,研究微RNAs(microRNAs)与靶点相互作用。方法在pEGFP-C1下游非编码区插入含miR-122a作用靶序列HCV 5′UTR,构建pEGFP-UTR载体,将miR-122a与pEGFP-UTR共转染HEK293细胞,观察增强绿色荧光蛋白EGFP表达强度变化,并与双荧光素酶报告系统比对。结果 miR-122a能明显抑制含UTR靶序列的EGFP蛋白表达,与双荧光素酶报告系统相比,绿色荧光蛋白在检测灵敏度上与双荧光素酶相接近。结论利用绿色荧光蛋白作为报告基因,能够清楚直观反映miRNAs与靶点作用情况。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

DRD2启动子低甲基化通过ERK通路调控乳腺癌细胞增殖

目的 研究肿瘤干细胞标志物多巴胺受体D2（dopamine receptor D2,DRD2）对乳腺癌细胞增殖的影响。方法 采用850K芯片对乳腺癌组织进行检测,并分析DRD2甲基化状态。采用基因筛选、基因敲除和甲基化抑制等技术和方法,进行体外和体内实验,筛选和验证可能存在的分子信号通路。结果 DRD2启动子区在乳腺癌组织中相较于正常组织表现为低甲基化。上调DRD2的表达后,乳腺癌细胞增殖增强,而下调DRD2的表达,乳腺癌细胞增殖显著降低。裸鼠实验发现,过表达DRD2可促进肿瘤生长和Ki67、CD31表达,下调DRD2可抑制肿瘤生长。体内外实验表明,细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）的表达受DRD2表达水平的影响,提示DRD2通过ERK信号通路发挥作用。甲基化抑制剂5-aza-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-AzadC）在小鼠体内部分逆转了DRD2表达的下调,失去了对肿瘤细胞增殖的抑制作用,提示抑制DRD2甲基化促进了肿瘤的发展。结论 乳腺癌中DRD2启动子区发生低甲基化。DRD2通过ERK通路在乳腺癌细胞的增殖和迁移中发挥作用。     

新型冠状病毒假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用

目的 构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒,优化假病毒制备条件并应用于中和抗体活性检测.方法 优化合成SARS-CoV-2刺突蛋白(S)基因,进行假病毒包装;通过Western blot检测S基因的表达;应用定量ELI-SA检测接种新冠灭活疫苗后血清中新型冠状病毒IgG抗体的滴度,同时应用假病毒中和实验对接种...     

稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.     

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。