HBcAg显性失活突变体质粒的构建及体外表达

目的：探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建及体外表达。方法：选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因片段，利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-C-GFP,并将该质粒转染肝癌细胞株HepG2。结果：通过RT－PCR检测到其RNA的表达，Confocal观察到GFP绿色荧光。结论：HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建成功可以进行对HBV作用的研究。     

SIRT7基因乙酰化活性缺失突变真核表达载体的构建

目的构建SIRT7基因乙酰化活性缺失的定点突变真核表达载体。方法用RT-PCR法从293T细胞中扩增SIRT7基因,并克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(-)A上。采用Two-step PCR定点突变技术,构建SIRT7基因的H187Y突变质粒,经测序确证定点突变成功,再将SIRT7及突变载体转染293T细胞,Western blot检测融合蛋白表达。结果克隆出SIRT7基因,构建了真核载体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7,经Two-step PCR获得突变体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y。DNA测序结果表明,编码187位氨基酸的560~562位碱基由CAC突变为TAC,其他碱基均无突变。SIRT7和H187Y突变载体转染293T细胞后,可检测出myc-SIRT7融合蛋白表达。结论成功构建了SIRT7以及H187Y突变的真核表达载体。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

乙型肝炎核心抗原基因的合成及其原核表达载体的构建

目的:合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因并构建原核表达载体.方法:根据大肠杆菌偏嗜性密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条相互重叠的寡核苷酸片段,采用PCR法扩增获得完整的HBcAg基因,经BamH I和Xho I双酶切后定向克隆到pET30a(+),得pET30a(≠)-HB-cAg,经PCR扩增、酶切及测序鉴定后,定点突变法改正错误位点.之后将重组子转入BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western Blot检测蛋白抗原性.结果:成功构建了重组质粒pET30a(≠)-HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌表达,表达效率64%左右;Wesbern Blot显示表达产物具有较好的抗原性.结论:成功合成HBcAg基因并构建了原核表达载体.     

伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定

目的：获得PRV gE主要抗原表位基因，构建PRV gE重组表达载体。方法：根据伪狂犬病病毒Min—A株gE基因序列，设计一对引物，采用PCR方法扩增PRV gE基因主要抗原表位区约642bp的片段，将产物克隆到PGEM-7Z载体中，测序正确后再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中，提取质粒作限制性内切酶分析和序列测定。结果：限制性核酸内切酶酶切鉴定表明，扩增出了PRV gE主要抗原表位基因，测序结果经BLAST分析与GenBank中注册的序列完全一致。结论：成功克隆了PRV gE主要抗原表位基因的原核表达载体。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

利用PCR技术构建GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白真核表达载体

目的 对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM－CSF／Feγ2^-融合蛋白真核表达载体。方法 通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM－CSF／Feγ2^-。并通过T－A克隆策略,把突变后的融合基因GM－CSF／Feγ2^-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-并经过酶切和测序确证。结果 成功对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行突变,构建了真核表达载体pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-。结论 利用该PCR方法进行基因定点突变可行。     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

目的：利用聚合酶链反应（PCR）技术对Wilson病（WD）基因进行体外定点突变的研究。方法：采用PCR定点突变技术，首先设计两对引物，将突变位点设计在引物上，通过重叠延伸法两次PCR扩增，扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。结果：DNA测序表明在预期位点已经发生突变，WD基因第778位密码子由精氨酸（Arg)残基突变为亮氨酸残基（Leu),用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。结论：PCR技术诱导定点突变准确，高效。Wilson病基因突变体的构建成功，为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达

目的：构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21（DE3）中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果：酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a／rmcAg,SDS—PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64．3％。结论：应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

目的；构建白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）单点突变重组质粒，为进一步探讨CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：采用PCR定点突变法，将CMD1编码C端3个苯丙氨酸（F89、F92和F141）的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基，构建CMD1单点突变重组表达质粒，并进行序列测定。结果：测序结果证实，所构建的3个重组质粒均含有相应的CMD1定点突变后的序列，F89^ ：TTC→GCT；F92^ :TTT→GCC；F141^ :TTT→GCC。结论：成功构建了3个CMD1单点突变重组表达质粒，为后续研究奠定了基础。     

PCR介导的ret基因体外定点突变

目的:利用PCR技术介导ret基因cDNA上第2 753位碱基的体外定点突变.方法:利用PCR技术进行定点突变,采用Dpn Ⅰ进行原始模板消化.经Amp抗性、PCR技术初步筛选,通过序列分析进行确证.结果:Amp抗性及PCR筛选结果均为阳性;序列分析提示,2 753处碱基由T→C.结论:成功完成了ret基因的体外定点突变.     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表达质粒的构建

目的 构建强制泛素化乙肝病毒核心抗原(HBcAg)融合基因真核表达质粒.方法 以HBV adr亚型全基因质粒pADR.为模板,PCR扩增HBcAg基因片段;无茵操作下分离Balb/C小鼠肝脏,提取mRNA,RTPCR扩增小鼠泛素基因片段.PCR产物经测序鉴定后双酶切,插入真核表达质粒pcDNA 3.1(-),构建重组真核表达质粒ub-HBcAg-pcDNA 3.1(-)酶切鉴定和基因测序.结果 扩增的泛素基因片段和HBcAg基因片段经测序证实序列正确;将上述基因双酶切后插入质粒pcDNA 3.1(-)中,构建强制泛素化rmcAg融合基因表达质粒ub-HBcAg-pcDNA3.1(-);融合基因真核表达质粒ub-HBcAG-pcDNA 3.1(-)经酶切、基因测序等鉴定证实目的基因序列和插入方向正确,与预期结果一致.结论 成功构建了强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因真核表达质粒,为进一步研究强制泛素化HBcAg诱导HBV特异性CTL奠定了实验基础.     

小鼠整合素β7基因克隆、序列分析及突变修复

目的:克隆小鼠整合素β7基因cDNA,同时对其序列进行分析,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.方法:采用RT-PCR的方法,从小鼠小肠PP结获得β7基因cDNA,克隆到pMD19-T载体,选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定,对造成氨基酸突变的碱基进行定点突变修复.结果:扩增得到的β7基因cDNA为2418bp,编码806个氨基酸,与GenBank中公布的序列比较,有10个碱基发生突变,其中造成氨基酸发生改变的有5个碱基,涉及3个氨基酸,对发生突变的5个碱基进行定点突变修复.结论:获得小鼠整合素β7基因的克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.     

HBcAg显性失活突变体质粒的构建及体外表达

目的探讨HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建及体外表达.方法选择编码乙肝核心抗原C基因片段及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因片段,利用基因重组技术构建成DNA质粒pCDNA4-CGFP,并将该质粒转染肝癌细胞株HepG2.结果通过RT-PCR检测到其RNA的表达,Confocal观察到GFP绿色荧光.结论HBcAg显性失活突变体质粒pCDNA4-C-GFP的构建成功可以进行对HBV作用的研究.     

bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

目的利用bcl-x微基因(minigene)构建重要顺式作用元件B2G、CRCE2的突变微基因,建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法以构建成功的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR的方法,按碱基互补配对原则设计能让顺式元件B2G,CRCE2定点突变的引物,进行PCR反应。PCR反应结束后,用DpnⅠ对模板质粒DNA进行消化,然后使PCR产物发生自身环化反应。将环化产物转化入感受态DH5α,通过筛选并最后利用测序来鉴定所构建突变微基因成功与否。结果测序结果鉴定,所克隆的突变微基因序列碱基无一错误突变。并且在HL-60细胞中,RT-PCR实验表明bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响,pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xS几乎消失,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xL/bcl-xS为1.6。结论成功构建及应用人类凋亡相关基因bcl-x的突变微基因,顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失,CRCE2突变使bcl...     

PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究

【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。【结果】DNA测序表明在预期位点已经发生突变 ,WD基因第 778位密码子由精氨酸 (Arg)残基突变为亮氨酸残基 (Leu) ,用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。【结论】PCR技术诱导定点突变准确、高效。Wilson病基因突变体的构建成功 ,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的:用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达进行分析与探讨。方法:利用ELISA方法,使得HBcAg基因片段扩增,构建含有HBcAg基因的表达质料与克隆质粒,以IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)plys中蛋白的重组表达,并且,采用酶联免疫测定方法检测重组蛋白。结果:在大肠杆菌中,重组HBcAg得到表达,经过酶联免疫测定方法检测,在预期位置显示有特异性条带。结论:采用基因工程的方法对乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达,成功构建了HBcAg原核表达系统,并获取重组HBcAg,有效地推进了重组蛋白的相关功能研究,具有很高的研究推广价值。     

利用PCR技术构建GM-CSF/Fc_(γ2)~-融合蛋白真核表达载体

目的　对融合基因GM -CSF Fcγ2 进行定点突变 ,去除其补体结合位点 ,构建GM -CSF Fcγ2-融合蛋白真核表达载体。方法　通过设计突变引物 ,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM -CSF Fcγ2-。并通过T -A克隆策略 ,把突变后的融合基因GM -CSF Fcγ2-重组到真核表达载体pRc CMV2中 ,构建真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-并经过酶切和测序确证。结果　成功对融合基因GM -CSF Fcγ2-进行了突变 ,构建了真核表达载体pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-。结论　利用该PCR方法进行基因定点突变可行     

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的；对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad-Easy载体系统进行表达。方法：采用大引物PCR方法，通过3条引物，两轮PCR反应，获得VP4基因的突变体，并经核酸序列分析证实。结果：PacⅠ识别的8个碱基序列TTAAT－TAA，突变为CTGATCAA。结论；大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便，快速的方法。