HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7的构建及克隆表达

目的研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法以HPV16型野毒株HPV16-114／K为模板,利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1(1-301aa)和转化蛋白E7(1-60aa)融合基因的重组质粒pUC19L1-E7,HPV16L1-E7DNA片段经质粒pBSLl-E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHGl0共转染293细胞,制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,密度梯度超迷离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP。结果成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7,制备HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,HPV16L1-E7融合蛋白可在293细胞中高效表达,可达细胞总蛋白的10％以上,并装配成嵌合病毒样颗粒(cVLP)。结论成功制备了可高效表达IPV16L1-E7嵌合L1-E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7载体疫苗,为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因,用来构建多价疫苗,因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

携带双启动子DNA疫苗载体的减毒沙门菌在体内定植及动态变化

目的：探讨双启动子DNA疫苗载体在减毒沙门菌中的稳定性和重组减毒沙门菌在小鼠体内的定植及动态变化。方法：将人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7转化减毒沙门菌S-SL3261，经口服、鼻饲和皮肤途径免疫小鼠，在免疫后的第3、4、5、6周取小鼠粘膜相关淋巴组织，电镜观察细菌在组织中的定植；组织匀浆，细菌培养计数确定细菌的增殖；从细菌中提取质粒酶切鉴定以确定质粒的稳定性。结果：重组减毒沙门菌S-SL3261能在小鼠脾脏、肝脏和粘膜相关淋巴组织中定植，电镜可检测到多个细菌定植灶；重组减毒沙门菌可有效进入机体细胞并有限增殖达6周，在第4～5周菌落数量达到高峰，然后逐渐减少以至最后被清除。pCN-16L1E7可在减毒沙门菌中稳定存在，载体的产量和酶切图谱没有明显变化。结论：双启动子DNA疫苗载体pCN-16L1E7与减毒沙门菌有较好的相容性，能够在小鼠体内定植及有限增殖。口服、鼻饲和皮肤粘膜接种途径均可有效地将减毒沙门菌携带的DNA疫苗载体导入粘膜相关淋巴组织。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

HPV 6b型E7基因与CRT基因真核融合表达质粒的构建

目的采用HPV 6b E7基因与钙网蛋白(Calretieulin,CRT)基因共连接方法,构建高特异性、能更加活化细胞免疫的HPVDNA疫苗。方法利用PCR技术分别获得HPV6bE7基因和CRT基因片段,与带GFP标记的真核表达质粒pCDNA 3．1 共连接。结果获得阳性重组表达质粒pCDNA 3．1 -GFP-HPV6b E7／CRT 180,经酶切鉴定及核酸序列测定证明真核融合表达质粒构建完成。结论HPV6b型E7基因与CRT基因真核融合表达质粒的成功构建为下一步建立高特异性、高效HPVDNA疫苗的研究打下基础。     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

HPV6b野生型E7基因与优化密码E7基因mRNA表达的分析

目的:构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)E7基因重组真核表达质粒,比较优化密码E7基因(hu-E7)与野生型E7基因(wtE7)在mRNA水平的表达差异,初步探讨优化密码增强E7基因表达的机制。方法:EcoRI和KpnI双酶切pUC-wtE7质粒,游离wtE7片段,定向克隆入pcDNA3的EcoRI和KpnI位点,构建含wtE7的重组真核表达质粒pcDNA3-wtE7;与含hu-E7的pcDNA3-huE7质粒同时体外脂质体转染人羊膜细胞(wish细胞),提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法,以β-actin做内参照半定量分析比较hu-E7与wtE7在wish细胞内的mRNA表达水平。结果:用EcoRI和KpnI双酶切重组表达质粒pcDNA3-wtE7可释放5.4kb和314bp两片段,说明质粒构建正确。RT-PCR结果显示,HPV6b-huE7与HPV6b-wtE7转染组在预计分子量190bp处均有明显特异性条带,对照组则无。凝胶成像分析仪半定量结果分析,二者无明显差异,无统计学意义P>0.05。结论:成功构建pcDNA3-wtE7真核表达质粒,并在wish细胞中获得特异性E7mRNA表达。HPV6b-hu-E7与HPV6b-wtE7基因在wish细胞内特异性E7mRNA的表达水平没有明显差异。     

减毒沙门氏细胞为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的：构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法：设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir，含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件，插入pTriEx真核启动子CMV IE下游，构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒16型L1L7，融合基因，插入pCMVnir，制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL3261，厌氧诱导表达，SDS－PAGE和Western blot分析检测Nir启动子的活性。结果：经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析，成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL3261，厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论：成功构建了一种与胞内寄生细菌（减毒沙门氏细菌）匹配的双启动子DNA疫苗新型载体，并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗。     

登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16E7基因，经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体，转化JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7，HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达，在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

重组全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的 构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗.初步评价疫苗的免疫应答效应.方法 将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗.疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA检测其诱导的抗体和细胞因子表达水平.结果 重组全酵母疫苗能够有效地表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够诱导出特异性抗HPV16-E7抗体,并促进Th1型细胞因子的表达.结论 研究结果 为进一步进行疫苗抗肿瘤免疫研究,提供了实验基础.     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的：构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因——迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersen-tivity antigen 1,DNA)与小鼠共刺激分子B7—1的嵌合重组质粒。方法：设计合成两对寡核苷酸引物，用PCR法分别从pUCmB7—ITM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7—1和DHA1的基因片段(921bp和984bp)，分别用HindⅢ，EcoRⅠ，XbaⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α，分别用上述内切酶酶切及DNA到序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论：该研究成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1，为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV 16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件.方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp 的DNA片段.将所得片段与pGEX-KG 载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆.其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功.提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG 诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV 16L1抗体发生特异性反应.结论:HPV 16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的：克隆并体外表达HPV58E6，为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础。方法：通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段，利用基因重组技术，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游，体外转录成mRNA后，在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白，化学发光法检测，X光胶片曙光显影鉴定，结果：酶切电泳证实质粒构建正确，SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带，X光胶片亦在相应位置出现印迹条带。结论：成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白，为其致癌作用和治疗的研究奠定基础。     

表达幽门螺杆菌UreB减毒鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的免疫保护作用

目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B亚单位（UreB)减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,研究其对小鼠抗H.pylori的免疫保护作用。方法：用PCR扩增ureB,将其克隆入高效原核表达质粒pTrc99A,进行基因测序,重组质粒鉴定后导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261。用SDS聚丙烯安凝胶电泳、Western blot和薄层扫描进行目的蛋白表达分析。C57BL／6小鼠用重组菌免疫,4周后用H.pyloriSS1攻击,再4周后处死小鼠,取胃做快速尿素酶试验和H.pylori定量培养,对照观察免疫效果。结果：构建了携带ureB的重组原核表达质粒pTrc99A-ureB,并将它成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261。重组菌SL3261(pTrc99A-ureB）表达了约66ku的UreB。与对照组相比,重组菌免疫组H.lpylori定植水平明显下降（P＜0．05）。结论：构建了表达H.pylori UreB的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,该菌株对C57BL／6有免疫保护作用。     

构建人乳头瘤病毒关键基因的原核重组载体

目的构建HPV16 E6／E7关键基因的原核载体pET-32（＋）-E6／E7并将其转到大肠杆菌BL-21（DE3）中诱导表达，最后获得E6／E7基因表达产物。方法用PCR方法从含有HPV16全基因序列的质粒中扩增E6／E7基因，将E6／E7基因连接到pET-32a（＋）质粒上，并转到大肠杆菌BL21（DE3）中。最后检测E6／E7基因。结果获得重组后的载体pET-32（＋）-E6／E7。结论成功构建表达了含有E6E7的原核重组载体，并在大肠杆菌中表达。