沙眼衣原体pORF5质粒蛋白单克隆抗体2H4的纯化及其免疫学特性研究

目的 纯化抗沙眼衣原体pORF5单克隆抗体2H4并鉴定其免疫学特性.方法 大量培养pORF5单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株并收集培养上清,采用G蛋白免疫亲和层析法纯化2H4单克隆抗体;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定2H4效价及抗体亚类;Western blot鉴定其特异性;免疫荧光试验(IFA)检测2H4单克隆抗体的衣原体种属特异性.结果 纯化后2H4抗体的纯度高达93％;效价为1:1024,免疫球蛋白类型为IgG2a;2H4抗体不仅能特异性识别pORF5融合蛋白,而且能特异性识别Ct血清型A、D、L2、鼠农原体(MoPn)、鹦鹉热嗜农原体(6BC)质粒所编码的内源性pORF5蛋白,但不识别衣原体其他质粒蛋白和肺炎嗜衣原体(Cpn).结论 获得了高纯度的能特异识别pORF5质粒蛋白的单克隆抗体,为进一步研究pORF5蛋白结构和功能以及沙眼衣原体诊断试剂盒的研制奠定了良好的基础.     

质粒蛋白pORF5在沙眼衣原体感染细胞中的定位及免疫原性研究(英文)

目的分析沙眼衣原体隐蔽性质粒编码的质粒蛋白pORF5在感染细胞中的定位并初步探讨免疫原性特征。方法 PCR扩增pORF5质粒蛋白编码基因,构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体转化大肠杆菌XL1-blue中诱导表达融合蛋白;融合蛋白经Glutathione Sepharose亲和层析纯化后免疫小鼠,制备单克隆抗体和多克隆抗体,间接免疫荧光技术及免疫印迹鉴定抗体的特异性,并分析pORF5质粒蛋白在感染细胞中的分布特征。采用ELISA方法分析pORF5质粒蛋白的免疫原性。结果 pORF5原核表达重组体成功构建,融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达;pORF5主要分布于宿主细胞胞浆,但也少量分布在EB、RB上;pORF5能与衣原体患者血清及鼠免疫血清发生强烈地免疫反应。结论 pORF5为衣原体分泌蛋白,并具有很强的免疫原性。     

HPV16E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞的定位及对凋亡的影响

目的 探讨外源人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)与人Daxx蛋白(hDaxx)在HeLa细胞内的亚细胞定位及诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 Western印迹法检测融合蛋白DsRed-HPV 16 E6和EGFP-hDaxx的表达.激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6和hDaxx的亚细胞定位.将HeLa细胞分为对照组、TNF-α处理组、转染空载体组、转染HPV16 E6组、共转染HPV16 E6和hDaxx组.后4组均经TNF-α诱导.用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-8与Caspase-3的相对活性.结果 融合蛋白DsRed-HPV16E6和EGFP-hDaxx在细胞内表达并分布于胞质与胞核,出现共定位现象,且部分hDaxx从胞核转移至胞质.转染E6组凋亡率(21.4％±1.1％)低于转染空载体组(27.0％±0.9％,P＜ 0.01);与转染E6组相比较,共转染组凋亡率(32.5％±2.1％)显著升高(P＜0.01).转染E6组Caspase-8和Caspase-3相对活性分别为0.057±0.003、0.054±0.006,均低于空载体组(0.092±0.012、0.093±0.005,均P＜0.01);与转染E6组相比较,共转染组Caspase-8和Caspase-3相对活性(0.109±0.013、0.110±0.004)均显著升高(P值均＜ 0.01).结论 HPV16 E6使部分hDaxx从胞核转位至胞质,二者发生共定位.HPV16E6蛋白可抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡,bDaxx高表达可下调HPV16 E6蛋白这种作用.     

hDaXX与12型腺病毒E1B55KD癌蛋白在体内外的结合反应

目的：研究12型糖尿病(Adenovirus 12,Ad12)E1B 55KD癌蛋白（Ad12E1B 55KD）打破hDaxx与急性早幼粒细胞性白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein,PML）在细胞核共定位的机制。方法：构建hDaxx原核细胞表达质粒pQE30/hDaxx，并在大肠杆菌（E.coli）BL21中诱导表达，用镍-氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖加以纯化。通过体内外共免疫沉淀反应，Western blot方法研究hDaxx与Ad12E1B55KD直接结合反应。结果：质粒qQE30/hDaxx在E.coli BL21中成功诱导表达了hDaxx,其N端有6个组氨酸分子附着（6His-hDaxx）.Wetern blot结果显示hDaxx在体内外与Ad12E1B 55KD发生直接结合反应。结论：表达并获得纯化的6His-hDaxx,hDaxx能在体内外与Ad12E1B55KD直接结合。     

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的：克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因，构建pEGFP／MOMP真核表达重组质粒，为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据．方法：用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段，克隆人真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中，阳性重组子经BanH I、Kpn I双酶切、PCR扩增及测序鉴定；并经脂质体介导转染HeLa细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果：PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMP基因片段；序列测定证实与GenBank卺录的D型沙眼衣原体一致；筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP／MOMP。结论：成功地构建了pEGFP／MOMP真核表达重组体，并在HeLa细胞中表达了MOMP。     

人型支原体和解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的敏感性研究

目的 探讨人型支原体和解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的敏感性，指导临床合理用药。方法 采用微量肉汤稀释法测定人型支原体和解脲脲原体对6种氟喹诺酮类药物的敏感性。结果 司帕沙星和加替沙星对人型支原体和解脲脲原体具有良好的抑菌活性，其MIC50分别为0．03125、0．25mg／L和0．25、0．50mg／L。左氧氟沙星和氧氟沙星对两种支原体的MIC50均分别为1．0、2．0mg/L。诺氟沙星对两种支原体的活性较差，MICl卯分别为16．0、32．0mg／L。环丙沙星对人型支原体的MIC50为2．0mg／L，而对解脲脲原体的MIC50则为8．0mg／L。结论 氟喹诺酮类药物新品种司帕沙星、加替沙星和左氧氟沙星的抗Mh和抗Uu活性强于环丙沙星和氧氟沙星等老一代氟喹诺酮类药物，本结果可为选择氟喹诺酮类药物治疗泌尿生殖道支原体感染提供实验依据。     

湖南省衡阳地区STD患者病原体检测

目的 了解衡阳地区性传播疾病(STD)患者病原体感染情况。方法 对2420例可疑STD患者进行检测：淋病奈瑟菌(NG)、解脲脲原体(UU)、人型支原体(MH)采用培养法；沙眼衣原体(CT)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)核酸采用聚合酶链反应(PCR)法；梅毒螺旋体(TP)采用快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)和TP-PA法。结果 STD病原体阳性检出率为38．1％(922／2420)。在922例中UU占29．6％，CT20．8％，HPV17．8％，NG17．4％，MH6．3％，HSV4．2％，TP3．9％。结论 衡阳地区STD患者中UU感染率最高，CT和HPV次之，TP感染率最低。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

妇康乐药液的杀菌性能观察

目的　进一步验证妇康乐药液在杀微生物方面的性能。方法　实验观察妇康乐药液的杀微生物作用、毒性作用与稳定性。结果　含 10 %妇康乐的水溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌、解脲支原体作用 2 0min ,杀灭率分别达 10 0 %、69.3%、10 0 %、60 .2 %、10 0 % ,杀菌效果随作用时间的延长而增加 ,2 0 %的小牛血清对其杀菌效果的影响较小。结论　该消毒剂具有较强的杀菌作用 ,对皮肤、粘膜无刺激 ,对人体无毒副作用     

慢性前列腺炎患者病原体感染状况的调查

本研究应用PCR与分离培养技术对1603例慢性前列腺炎(Chronic Prostatitis,CP)患者的前列腺液进行了病原体的检测。结果显示：表皮葡萄球菌、Gc、类白喉杆菌、其它细菌、Ct、Uu、Mh、Cd的检出率分别为45．5％、5．1％、7．3％、8．2％、26．4％、30．5％、25．1％和4．5％,混合感染率为25．3％。调查结果表明：表皮葡萄球菌是慢性细菌性前列腺炎的主要病原体,而Ct、Uu、Mh是慢性非细菌性前列腺炎的主要病原体。