广东省传染性非典型肺炎病原体的分离鉴定及检测结果分析

目的 对引起广东省传染性非典型肺炎(SARS)的病原体进行分离鉴定，并分析各市首发病例、死亡病例、各个阶段病例的检测情况，为该病的诊断和防治提供依据。方法 对2003年1～5月份采自广州、肇庆、江门、汕头、中山、河源、珠海等地的SARS病例的咽拭子、咽漱液等标本，用Vero—E6、Vero、MDCK、Hep—2、传代人胚肺5种细胞进行分离培养，并使用电镜、间接免疫荧光(IFA)、PCR及基因序列测定等方法对分离物进行鉴定，应用ELISA、荧光定量PCR等技术分别对各个阶段SARS病例的血清及咽拭子等标本进行检测。结果 5种细胞接种上述病人咽拭子标本后，均有部分出现细胞病变，电镜观察可找到冠状病毒样颗粒。分离物扩增出冠状病毒特异基因片断。分离物与病人恢复期血清抗体发生特异性反应。1～5月的病例标本SARS冠状病毒PCR阳性率分别为100．00％(2／2)、76．19％(16／21)、71．74％(33／46)、20．00％(18／90)、6．36％(11／173)；SARS冠状病毒抗体IgG阳性率分别为100．00％(2／2)、78．57％(11／14)、58．33％(14／24)、30．3％(10／33)、12．50％(9／72)。河源、佛山、肇庆、中山、东莞、珠海六市首发病例均检测出SARS冠状病毒I弗抗体。10个死亡病例中8例检测出SARS冠状病毒基因或相关抗体。结论 SARS冠状病毒是引起本次广东省SARS流行的主要病原体；不同时期SARS冠状病毒特异基因片断和抗体的检出率明显不同。     

江苏省传染性非典型肺炎病原学检测研究

目的:建立传染性非典型肺炎(SARS)实验室检测方法,为SARS病例诊断和现场防治提供依据。方法:用逆转录套式PCR、实时荧光定量PCR检测SARS病毒核酸;酶联免疫法检测血清标本SARS病毒IgM抗体;部分PCR检测阳性或SARS病毒IgM抗体阳性病例的标本进行直接电镜观察;简并引物PCR检测冠状病毒属病毒核酸;鉴别诊断IFA检测血清中肺炎支原体等9种常见呼吸道感染病原IgM抗体,PCR检测军团菌以及甲、乙型流感病毒核酸。结果:检测各类临床标本506份。2003年全省报告临床诊断病例7例,5例检测结果阳性;逆转录套式PCR检测各类标本132份,阳性8份;对其中4份PCR扩增产物(108bp)进行了序列分析,与SARS病毒序列100%同源;实时荧光定量PCR检测各类标本30份,阳性3份;酶联免疫法检测血清标本101份,SARS病毒IgM抗体阳性4份;3个诊断病例的各类标本电镜检查发现冠状病毒样颗粒;IFA检测血清标本75份,嗜肺军团菌IgM抗体阳性9份,乙型流感IgM抗体阳性11份,两者同时阳性3份,其他病原体IgM抗体均为阴性。不明发热病例的标本21份简并引物PCR检测冠状病毒,2份咽拭子标本阳性;漱口液、尿液标本各15份PCR检测军团菌、漱口液25份PCR检测甲、乙型流感病毒结果均为阴性。结论:本研究建立的检测方法与临床诊断有比较好的符合性,对于临床诊断和防治工作具有重要的参考价值。PCR检测SARS-CoV特异性较好,而敏感性有待提高。     

Hep-2细胞在严重急性呼吸综合征病原学检测中的应用研究

目的 应用人咽喉上皮癌细胞(Hep-2)对严重急性呼吸综合征(SARS)病例标本进行病原体检测与研究，为该病的预防与控制提供依据。方法 采用Hep-2细胞培养法，对2003年l～2月广东省收集的SARS病例的咽拭子等标本分离致病病原体，并应用电镜形态学、逆转录．多聚酶链反应(RT-PCR)扩增部分基因进行序列分析，并对分离的病原体进行研究。结果 132例SARS病例的3l份咽拭子、100份痰液和l份尸检肺组织标本中有73份标本致单层细胞出现“蚀斑病变”，细胞病变阳性率为55．3％，其中48h阳性率为36．4％。采用巢式PCR(Nested-PCR)对其中25份出现“蚀斑病变”细胞培养物进行检测，能扩增出冠状病毒的特异片段；对中2-18、中2-19等6份Nested-PCR产物进行基因序列分析，结果 显示其核苷酸序列与国内外公布的结果一致，氨基酸序列与已知的人或动物冠状病毒的同源性在58％～76％之间。通过电镜在SARS病例标本(中2-10)病变细胞及l份尸检肺组织标本中观察到衣原体样颗粒和病毒样颗粒。结论 从接种SARS病例标本的Hep-2细胞病变培养物中证实有冠状病毒。     

Vero-E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒敏感性的研究

目的 研究Vero—E6、MDCK、293细胞对SARS冠状病毒的敏感性，为该病的病原学研究、诊断和疫苗制备奠定基础。方法 用Vero—E6、MDCK及293细胞对广东省部分SARS病人的咽拭子标本进行分离培养，并对分离物使用电镜、间接免疫荧光(IFA)及荧光定量聚合酶链反应(FQ—PCR)的方法分别检测细胞和(或)培养上清波中的病毒含量。结果 感染SARS病人的咽拭子标本后，Vero—E6细胞出现病变(CPE)最早，电镜中可观察到Vero—E6细胞中大量的病毒颗粒，IFA试验感染病毒的Vero—E6细胞与SAPS病人的恢复期血清呈强阳性反应，FQ—PCR结果显示Vero—E6感染细胞内的病毒含量10^8拷贝／ml，高于293细胞(10^6拷贝／ml)及：MDCK(104拷贝／ml)。结论 三种细胞对SARS相关病毒的敏感性不同，Vero—E6是SARS相关病毒最敏感的宿主细胞。     

改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。     

SARS病例尸解标本和咽嗽液中病原体检测

目的 确定严重急性呼吸系统综合征(SARS)病例尸解肺组织和咽嗽液中病原体种类。方法 用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本，用RT-PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特异核酸片段，并进行序列测定。结果 在死亡病人肺组织中观察到衣原体的网状体、中间体以及原体颗粒，并见衣原体包涵体样结构；用RT-PCR法在2例尸解肺组织扩增出预期大小的DNA片段，测序后经相似性(BLAST)比较，其与SARS冠状病毒相应基因片段高度同源；用巢式RT-PCR技术在SARS病人咽漱液中扩增出SARS冠状病毒特异基因片段。结论 在SARS尸解肺组织中发现衣原体样颗粒，在尸解肺组织和咽漱液中扩增出SARS冠状病毒核酸片段，说明SARS患者可合并衣原体等微生物混合感染。     

河南省一株SARS冠状病毒的分离与鉴定报告

目的细胞培养分离新型“SARS冠状病毒变异株”。方法采用Vero细胞组织培养方法获得河南一株SARS冠状病毒分离株,应用核糖核酸(RNA)和逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行病毒鉴定。结果在5个PCR扩增物中出现强阳性反映带;该毒株与北京SARS—CoVBJO1株进行DNA序列比较,在相应区域共2170bp的DNA序列比较,序列同源性为99.5%。结论证实该病毒是我省首次成功分离到一株新型SARS冠状病毒变异株。     

荧光定量PCR检测传染性非典型肺炎冠状病毒的分析

目的 探讨荧光定量PCR在检测传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒(SARS—CoV)中的应用。方法 对2003年1～4月广州市各大医院送检的临床确诊或疑似的SARS病例以及密切接触的咽漱液和咽拭子进行荧光定量PCR检测。结果 从57份确诊患标本中检出SARS-CoV阳性38份，检出率为66．7％。14份密切接触标本中检出阳性7份。59份疑似患标本中检出阳性12份。SARS发病10～12d时SARS—CoV检出率最高，达87．5％。结论 荧光定量PCR能早期、快速检出SARS—CoV，临床符合率达66．7％，采样时间在发病1～12d最佳。     

一起公共场所传染性非典型肺炎暴发的流行病学分析

目的 对一起公共场所传染性非典型肺炎(SARS)暴发的流行状况和因素进行调查分析，为制定预防控制措施提供依据。方法 用统一的个案调查表对一起公共场所聚餐所致的SARS暴发病例及相关的所有病例进行调查，采集部分病例咽漱液、血清分别用荧光定量PCR测定SARS抗原和用ELISA测定SARSIgG、IgM。结果 2003年2月21～28日广州市芳村区某酒楼9名就餐聚餐后全部陆续发病，其中1人死亡，所有病例临床表现符合卫生部SARS临床诊断标准。用荧光定量PCR测定3例患咽漱液，2例SARS冠状病毒阳性；用ELISA法测定5例患血清，3例SARS冠状病毒特异性IgG抗体阳性，1例(指示病例)IgM抗体阳性。本起暴发发生于通风不良小型餐厅包房内，聚餐停留玩纸牌和进餐，时间长达3h。首例患于聚餐后次日(21日)发病，聚餐前多次到过SARS收治医院的呼吸病区看护患肿瘤的父亲(父亲和曾去医院看护的另2名亲属也分别在指示病例发病同日及10d内发病)，其余8名聚餐病前除这次聚餐外无其他明确的接触史或暴露史。病例发病潜伏期为2～8d，平均5d。结论 证实本次暴发是因长时间在通风不良的公共场所聚会所导致的SARS暴发，主要传播途径可能为近距离的飞沫传播和密切接触传播，潜伏期末的病人具有传染性。     

上海地区SARS患者冠状病毒样颗粒培养与分离

目的 对上海地区SARS患进行病原体的培养10分离。方法 复旦大学公共卫生学院与上海市疾病预防控制中心合作,对上海地区第1例、第2例SARS确诊病例咽拭标本接种多种细胞,进行病原分离、观察。结果 在第1例SARS确诊病例咽拭标本感染的Vero E6细胞观察到CPE;经超速离心、电镜负染观察见到了直径在60～100nm的冠状病毒样颗粒;感染的VeroE6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性。此株冠状病毒样颗粒暂时命名为SARS—CoV—Fudan I株。结论 在上海市的第1例确诊SARS病例的咽试培养中,见到新型冠状病毒样的颗粒。     

SARS molecular detection external quality assurance

Inactivated severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus samples were used for an external quality assurance study within the World Health Organization SARS Reference and Verification Network and other reference institutions. Of 58 participants, 51 correctly detected virus in all samples > or =9,400 RNA copies per milliliter and none in negative samples. Commercial test kits significantly improved the outcome.     

Mice susceptible to SARS coronavirus

Murine models of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV) will greatly advance research on this emerging virus. When BALB/c mice were simultaneously inoculated intranasally and orally, replication of SARS-CoV was found in both lung and intestinal tissue.     

加深了解非典,战胜非典

随着全球科学家的努力，对SARS及其病原体的认识愈来愈深入。本文对非典型肺炎(非典)名称的由来、传统非典型肺炎的病原体、SARS病原体的发现过程及冠状病毒本质的争论、SARS的流行病学调查、SARS病毒在人体内存在的部位和抵抗力、SARS的传播途径及来源问题、SARS的实验室诊断及免疫预防等方面予以介绍。     

SARS大事记

2002年11月～12月,在广东,一种神秘的肺炎相继在广东的河源、深圳、中山等地被发现。 2003年1月2日 广东首次正式向中央报告,发现一种与以往的肺炎都不相同的非典型肺炎,传染性强,潜伏期短。 2月11日 在广东省卫生厅召开的情况通报会上,呼吸内科专家、中华医学会呼吸分会会长钟南山院士首次公开指出:此次非典型肺炎有可能是病毒的亚型或变种引起。 广东省卫生厅通报:截止2月9日下午,广东省发现305例非典型肺炎病人,其中广州市226例。     

再战"非典"

2004年4月23日，中国卫生部新闻发言人报告，经卫生部专家组复核，安徽省发现一例传染性非典型肺炎确诊病例和一例疑似病例，北京22日报告的疑似病例确诊，并新增一名疑似病例，有专家疑源自实验室感染。     

Detection of SARS coronavirus in patients with suspected SARS

Cases of severe acute respiratory syndrome (SARS) were investigated for SARS coronavirus (SARS-CoV) through RNA tests, serologic response, and viral culture. Of 537 specimens from patients in whom SARS was clinically diagnosed, 332 (60%) had SARS-CoV RNA in one or more clinical specimens, compared with 1 (0.3%) of 332 samples from controls. Of 417 patients with clinical SARS from whom paired serum samples were available, 92% had an antibody response. Rates of viral RNA positivity increased progressively and peaked at day 11 after onset of illness. Although viral RNA remained detectable in respiratory secretions and stool and urine specimens for >30 days in some patients, virus could not be cultured after week 3 of illness. Nasopharyngeal aspirates, throat swabs, or sputum samples were the most useful clinical specimens in the first 5 days of illness, but later in the illness viral RNA could be detected more readily in stool specimens.     

美国缘何SARS没有死亡

SARS的死亡率不断调高，加拿大多伦多地区发现100多名患者和超过20人死亡。但同为北美大国的美国，却以惊人的低发病率让人们对其保护公共卫生的能力刮目相看。