siRNA靶向干扰IL28RA基因对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)靶向干扰白细胞介素28受体α(interleukin 28 receptor alpha,IL28RA)基因对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用?方法:设计合成干扰IL28RA基因表达的3对siRNA(siRNA-6158?siRNA-6160?siRNA-6162),采用脂质体转染原代乳大鼠心肌细胞,分为正常对照组?单纯缺氧复氧组?缺氧复氧+阴性对照转染组?缺氧复氧+siRNA-6158转染组?缺氧复氧+siRNA-6160转染组?缺氧复氧+siRNA-6162转染组,探索siRNA转染心肌细胞的合适浓度,检测心肌细胞存活率?培养液中LDH的水平及心肌细胞IL28RA蛋白表达,观察siRNA干扰IL28RA基因对心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用?结果:采用脂质体转染法,siRNA浓度在80 nmol/L对心肌细胞具有较高的转染效率?与单纯缺氧复氧组和缺氧复氧+阴性对照转染组比较,缺氧复氧+siRNA-6158转染组和缺氧复氧+siRNA-6160转染组的LDH活性明显降低(P < 0.05),心肌细胞存活率明显升高 (P < 0.05),IL28RA蛋白表达明显减少(P < 0.05)?结论:干扰IL28RA基因的表达有望成为保护缺氧复氧心肌损伤的重要手段?     

丹参酮ⅡA对HUVEC细胞间缝隙连接的作用

【目的】探讨丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对人胎脐静脉上皮细胞(HUVEC)缝隙连接细胞通讯(GJIC)的影响及其机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测丹参酮ⅡA对HUVEC细胞生长的影响,荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析GJIC功能变化,并与阳性对照药全反式维甲酸(ATRA)比较,采用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)法分析Cx37、Cx40 m RNA的表达。【结果】丹参酮ⅡA作用HUVEC 24、48 h的半数致死量(IC50)分别为15、8.5μmol/L,32、64μmol/L丹参酮ⅡA作用HUVEC 48 h有明显细胞毒性,抑制率大于70%;选用0、4、8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA作用HUVEC48 h,流式细胞仪检测结果显示:各组接受绿色荧光Calcein-AM的细胞数量与总细胞数比值明显升高,其中8、16、32μmol/L组可显著提高GJIC功能(P0.01)。q RT-PCR分析结果显示:与空白对照组比较,8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA组可显著提高Cx37、Cx40 m RNA表达(P0.05或P0.01),并有一定的浓度依赖关系。【结论】丹参酮ⅡA能够提高Cx37、Cx40 m RNA表达,这可能是丹参酮ⅡA增强上皮细胞GJIC功能的机制之一。     

RUNX1在Ang Ⅱ诱导心肌肥厚中的作用及机制

目的 探讨Runt相关转录因子1(RUNX1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥厚的作用及机制。方法 将H9C2心肌细胞分为Control组、L-Ang Ⅱ组、M-Ang Ⅱ组、H-Ang Ⅱ组,验证Ang Ⅱ诱导心肌肥厚模型并检测不同Ang Ⅱ浓度下RUNX1表达情况。将H9C2心肌细胞分为慢病毒转染无义序列(NS)组、AngⅡ+NS组、shRUNX1组、AngⅡ+shRUNX1组检测RUNX1对心肌肥厚的影响。采用Western blot法检测各组细胞RUNX1、SERCA2a表达量的变化,采用qRT-PCR法检测各组细胞心肌肥厚相关指标,采用免疫荧光法检测心肌细胞面积。结果 在H9C2中加入AngⅡ48 h后,与对照组相比,Ang Ⅱ处理后细胞中RUNX1蛋白表达量明显上调,并呈剂量依赖关系。转染shRUNX1 72 h后进行Ang Ⅱ处理,与AngⅡ+NS组相比,AngⅡ+shRUNX1组BNP mRNA、RUNX1蛋白表达量明显降低,心肌细胞面积显著减小;而SERCA2a蛋白表达量明显上调。结论 RUNX1参与AngⅡ诱导的心肌肥厚的病理过程,其作用机制可能与抑制SERC...     

曲美他嗪对缺氧/复氧心肌细胞焦亡的影响

目的探讨曲美他嗪(TMZ)对急性缺氧/复氧(H/R)心肌细胞焦亡的影响。方法选择大鼠胚胎H9C2心肌细胞为研究对象,将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组。H/R组、H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞行缺氧12 h/复氧4 h处理模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤; H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞在构建H/R模型前分别给予50、100、500μmol·L~(-1)TMZ共孵育1 h;正常对照组细胞常规培养;采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测各组心肌细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组心肌细胞培养基中LDH活性,采用实时荧光定量聚合酶链反应法和Western blot法检测心肌细胞中Caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和Nod样受体蛋白3(NLRP3) mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与正常对照组比较,H/R组心肌细胞活性降低,LDH活性显著升高,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平升高(P <0. 05);与H/R组比较,H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组、H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性显著增加,LDH活性显著下降,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平降低(P <0. 05);与H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组和H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组比较,H/R+100μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性增加,LDH活性下降,细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平降低(P <0. 05); H/R+50μmol·L~(-1)TMZ组细胞活性、LDH活性、细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达水平与H/R+500μmol·L~(-1)TMZ组比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 TMZ能通过抑制细胞焦亡对H/R的心肌细胞起保护作用; TMZ处理心肌细胞的最适浓度为100μmol·L~(-1)。     

EPO预处理对心肌缺氧复氧损伤保护作用的研究

目的建立大鼠心肌缺氧复氧损伤模型,观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)预处理是否具有心肌保护作用.方法Wistar成年雄性大鼠60只分为3组,分别为对照组,缺氧复氧损伤组(H/R组)、EPO预处理组(EPO组),每组20只,EPO组大鼠经腹腔注射5 000u/kg的重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,RHuEPO),对照组和H/R组则注射同体积的生理盐水.给药24h后,将EPO组和H/R组大鼠置于常压缺氧环境中(O2 7%,N293%)12h后,移至常压常氧环境中2h,采取血及心肌标本,检测血清心肌酶活性、心肌细胞凋亡、心肌超微结构、心肌细胞MDA等指标,分别于复氧30、60、120min观察心脏血流动力学指标.免疫组化染色检测心肌细胞EPO受体(EPOR)蛋白表达及分布.结果成年大鼠心肌细胞EPOR蛋白呈弱阳性表达,分布于心肌细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞膜;与H/R组大鼠比较,EPO预处理减轻大鼠心肌缺氧复氧后细胞超微结构的损伤,降低血清心肌酶活性,抑制心肌细胞凋亡,减轻心肌过氧化损伤,并促进复氧后心功能的恢复.结论成年大鼠心肌细胞能够表达EPOR蛋白;EPO预处理对大鼠心肌缺氧复氧损伤具有保护作用.     

丹参酮ⅡA预处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

目的:观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)预处理对心肌缺血再灌注损伤后线粒体通透性的影响。方法:使用SD大鼠,在TanⅡA预处理5d后进行心肌缺血/再灌注损伤造模并检测心肌梗死面积、肌钙蛋白表达,使用酶联免疫吸附法观察线粒体通透性转换孔(MPTP)开放性以及细胞色素C释放情况。结果:TanⅡA预处理能够减轻心肌梗死面积、减少肌钙蛋白表达;抑制MPTP开放以及细胞色素C释放。结论:TanⅡA预处理能够通过抑制MPTP、减少心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用。     

尾加压素Ⅱ致体外培养乳鼠心肌细胞肥大效应研究

目的 观察尾加压素Ⅱ(Urotensin Ⅱ,U Ⅱ)对心肌细胞肥大的效应.方法 以体外培养的SD乳鼠心肌细胞为实验模型,分为正常对照组,单纯U Ⅱ作用组,环胞素A(CsA)阻断组.用real-time PCR方法分析β-MHC、 CaN(钙调神经磷酸酶)mRNA表达的变化,用免疫印迹法(Western blot)研究心肌肥大过程中β-MHC、CaN蛋白表达的变化,探讨U Ⅱ对心肌细胞肥大的影响.结果 ①随着U Ⅱ浓度的增加,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达明显增加,其中10-8 、10-7 mol/L U Ⅱ组与对照组相比较差异显著(P<0.05);②用10-8 mol/L U Ⅱ处理心肌细胞12、24、48 h,随着时间增加,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达呈递增趋势,其中处理24 h组与正常对照组有显著差异(P<0.05);③预先用环胞素A 5μmol/L(cyclosporin A CsA)处理正常心肌细胞24 h,然后用10-8 mol/L U Ⅱ作用24 h,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达与正常心肌细胞经10-8 mol/L U Ⅱ单纯作用24 h差异有显著意义(P<0.05).结论 U Ⅱ能够诱导心肌细胞的肥大,环胞素A(CsA)能阻断此效应,CaN参与了U Ⅱ诱导的心肌肥大过程.     

丹参酮ⅡA通过NLRP3炎症体信号通路对小胶质细胞糖氧剥夺/再灌注损伤的保护作用

目的 探讨丹参酮ⅡA对小胶质细胞BV-2糖氧剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R）损伤的保护作用及其机制。方法 取对数生长期的BV-2细胞OGD 3 h后再灌注4~24 h,采用Western blot筛选细胞内Nod受体蛋白3（NLPR3）表达水平最高的再灌注时间。 将实验组细胞OGD处理3 h后分别加入终质量浓度为0~2.5 μg/mL的丹参酮ⅡA,CCK8法检测细胞存活率,筛选丹参酮ⅡA的最大有效质量浓度。对BV-2细胞OGD 3 h后分别加入0、0.5 、1.0、2.0 μg/mL丹参酮ⅡA,再灌注12 h,Western blot检测BV-2细胞内NLRP3和凋亡蛋白caspase-1的表达水平,ELISA检测BV2细胞白介素（IL）-1β和IL-18的质量浓度。结果 OGD 3 h后,再灌注12 h时NLPR3蛋白表达水平最高。CCK8法显示丹参酮ⅡA最大有效质量浓度为2.0 μg/mL。NLRP3、caspase-1、 IL-1β和IL-18表达均随着丹参酮ⅡA质量浓度的升高而降低。结论 丹参酮ⅡA能抑制OGD/R处理后BV-2细胞内NLRP3炎症体信号通路分子的表达,这可能是其保护OGD/R细胞的分子机制之一。     

钙调蛋白激酶Ⅱ信号转导途径在血管紧张素Ⅱ致心肌肥大反应中的调控作用

目的 研究钙调蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)途径在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞肥大反应中的作用.方法 原代培养乳鼠心肌细胞,分为对照组(不加任何干预因素),肥厚组(Ang Ⅱ刺激心肌细胞肥大),缬沙坦组(缬沙坦直接作用于心肌细胞)和预处理组(缬沙坦进行干预30 min后,加入AngⅡ刺激心肌细胞).测定心肌细胞3H-亮氨酸掺入作为心肌细胞肥大的指标;用RT-PCR和Western blot法检测心肌细胞CAMK Ⅱδ的mRNA和蛋白质表达的水平.结果 ①AngⅡ在10-9～10-6 mol/L范围内剂量依赖性地增加乳鼠心肌细胞的3H-亮氨酸掺入.选择10-7 mol/L AngⅡ作用心肌细胞48 h为成功的心肌细胞肥厚模型.② AngⅡ(10-7 mol/L)处理心肌细胞48 h,可使3H-亮氨酸掺入明显增加,该作用可被缬沙坦明显抑制.③与对照组相比,肥厚组心肌的CAMKⅡδ mRNA水平显著增加;而缬沙坦预处理组较之肥厚组则显著下降.④与对照组相比,肥厚组心肌的CAMK Ⅱδ的蛋白质表达显著增加;而缬沙坦预处理组的CAMKⅡδ蛋白质表达水平较之肥厚组则显著下降.结论 ①CAMKⅡ信号转导通路激活是AngⅡ介导的心肌肥大反应重要环节之一.②缬沙坦抑制Ang Ⅱ介导心肌肥大反应的机制可能部分是通过抑制CAMKⅡδ的表达而实现的.     

lncRNA JPX靶向miR-378参与丹参酮Ⅱ A对结肠癌SW620细胞增殖、克隆、凋亡的影响

目的 研究lncRNA JPX靶向miR-378参与丹参酮Ⅱ A对结肠癌SW620细胞增殖、克隆、凋亡的影响及机制.方法 结肠癌SW620细胞分成对照组、丹参酮Ⅱ A组(丹参酮Ⅱ A处理)、vector组(转染阴性对照载体)、JPX组(转染pcDNA-JPX)、丹参酮Ⅱ A+vector组(转染阴性对照载体,然后给予丹参酮Ⅱ A处理)、丹参酮Ⅱ A+JPX组(转染pcDNA-JPX,然后给予丹参酮Ⅱ A处理)、丹参酮Ⅱ A+JPX+miR-NC组(共转染pcDNA-JPX、mimics control,然后给予丹参酮Ⅱ A处理)、丹参酮Ⅱ A+JPX+miR-378组(共转染pcDNA-JPX、miR-378 mimics,然后给予丹参酮Ⅱ A处理)、丹参酮ⅡA+Anti-NC组(转染inhibitor control,然后给予丹参酮Ⅱ A处理)、丹参酮Ⅱ A+Anti-miR-378组(转染miR-378 inhibitor,然后给予丹参酮Ⅱ A处理).CCK-8检测细胞增殖,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡.荧光素酶报告系统检测定JPX和miR-378的靶向关系.结果 与对照组比较,丹参酮Ⅱ A组结肠癌SW620细胞存活率、克隆形成数目均降低,凋亡率升高(P＜0.05).与vector组比较,JPX组结肠癌SW620细胞存活率、克隆形成数目均升高,凋亡率降低(P＜0.05).与丹参酮Ⅱ A+vector组比较,丹参酮Ⅱ A+JPX组结肠癌SW620细胞存活率、克隆形成数目均升高,凋亡率降低(P＜0.05).与丹参酮Ⅱ A+Anti-NC组比较,丹参酮Ⅱ A+Anti-miR-378组结肠癌SW620细胞存活率、克隆形成数目均升高,凋亡率降低(P＜0.05).与丹参酮Ⅱ A+ JPX+ miR-NC组比较,丹参酮Ⅱ A+JPX+ miR-378组结肠癌SW620细胞存活率、克隆形成数目均降低,细胞凋亡率升高(P＜0.05).JPX靶向促进miR-378表达.结论 丹参酮Ⅱ A通过下调JPX靶向miR-378诱导结肠癌SW620细胞凋亡.     

仙茅苷对H2O2氧化损伤心肌细胞的保护作用

目的探讨仙茅苷对H2O2氧化损伤心肌细胞的保护作用及机制。方法体外培养大鼠原代心肌细胞,将其分为空白对照组、DMSO溶剂对照组（0.1%）、H2O2氧化损伤组（200μmol/L）、槲皮素干预组（槲皮素30μmol/L＋H2O2200μmol/L）、低浓度仙茅苷干预组（仙茅苷0.5μmol/L＋H2O2200μmol/L）、中浓度仙茅苷干预组（仙茅苷5μmol/L＋H2O2μmol/L）、高浓度仙茅苷干预组（仙茅苷50μmol/L＋H2O2200μmol/L）。用H2O2氧化损伤经槲皮素及不同浓度仙茅苷预培养24 h的心肌细胞,18 h后测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量、心肌细胞内丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）含量,并测定心肌细胞的凋亡率和生长抑制率。结果 H2O2氧化损伤后LDH、MDA含量明显升高,GSH-px活性明显下降,细胞抑制率和凋亡率均增加（P〈0.01）;而经槲皮素、不同浓度的仙茅苷预处理组的心肌细胞,LDH、M DA含量明显下降,GSH-px活性明显升高,细胞生长抑制率和凋亡率均降低（P〈0.01）;且仙茅苷对心肌细胞氧化损伤的保护作用呈浓度依赖性。结论仙茅苷预处理心肌细胞可保护H2O2所诱导的氧化损伤,其作用可能与抑制脂质过氧化、增加抗氧化酶活性、减少心肌细胞凋亡有关。     

丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞心肌方向分化间隙连接蛋白43表达的干预作用

【目的】研究丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌方向分化间隙连接蛋白43(Cx43)表达的干预作用。【方法】体外培养大鼠MSCs,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫荧光技术检测不同组间MSCsCx43表达。【结果】未分化的MSCs上Cx43有弱的表达;5-氮胞甙(5-aza)、正常心肌上清液以及缺氧心肌上清液诱导后Cx43的表达显著升高(P<0.01);丹参酮高剂量组(1.5×10-7 mol/L)Cx43的表达量显著增加(P<0.05),丹参酮低剂量组(1.5×10-8mol/L)也显著升高(P<0.01);经缺氧心肌上清液和丹参酮共同干预后,Cx43表达较对照组均显著升高,但丹参酮低剂量组作用更加显著(P<0.01);缺氧心肌上清液和丹参酮低剂量组联合干预之后Cx43表达接近正常心肌细胞组(P>0.05),各组间荧光强度的变化与RT-PCR和Western blotting的结果一致。【结论】不同浓度丹参酮ⅡA可上调MSCs上Cx43表达,但丹参酮ⅡA和缺氧心肌上清液联合诱导作用更强。     

LPS预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨14-3-3γ基因在LPS预处理对抗心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用。方法构建pSU-PER/14-3-3γRNA干扰重组质粒,转染入心肌细胞,分为5组:对照组、A/R组、LPS+A/R组、pSUPER+LPS+A/R组、pSUPER/14-3-3γ+LPS+A/R组。Western blot检测14-3-3γ蛋白表达,生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果 A/R损伤使细胞存活率下降,LDH升高,细胞凋亡增加,mPTP开放;LPS预处理可使14-3-3γ表达明显增加,通过抑制mPTP开放,对A/R损伤的细胞有保护作用;pSUPER/14-3-3γRNA干扰重组质粒通过抑制14-3-3γ蛋白表达,取消LPS预处理的保护作用。结论 LPS预处理可对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤,其机制与上调14-3-3γ,从而抑制mPTP开放有关。     

心肌营养素-1预处理减轻缺氧复氧对心肌细胞损伤的机制研究

目的观察心肌营养素-1(CT-1)预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型细胞损伤、凋亡及血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响,进一步探讨其心肌保护机制。方法选择H9C2大鼠心肌细胞株,实验分为对照组、缺氧复氧组(H2/R24组)、各浓度CT-1预处理组,酶标仪检测细胞上清中LDH释放率,RT-qPCR检测HO-1 mRNA,Western Bolt检测活Cleaved Caspase3及HO-1蛋白。设计合成靶向HO-1的特异性siRNA片段,通过脂质体转染至H9C2细胞中,48 h后给予CT-1预处理及缺氧复氧(si-HO-1组)并重复检查HO-1 mRNA及蛋白的表达、LDH释放率、Cleaved Caspase3表达验证干扰效果。结果与H2/R24组相比,各浓度CT-1预处理组细胞上清LDH释放率下降,Cleaved Caspase3表达减少,而HO-1 mRNA及蛋白表达水平与H2/R24相比均明显增加。经siRNA干扰后,si-HO-1组HO-1表达水平与对照组相当,较H2/R24组、CT-1组则明显减少;而LDH释放率、Cleaved Caspase3蛋白表达较H2/R24组下降,而较CT-1组升高。结论 CT-1能通过上调HO-1表达,减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。     

UbcH10基因沉默联合紫杉醇干预对NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响。方法化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照。以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。结果Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P0.01)。MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P0.05)。siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性。     

促凋亡蛋白Bid介导模拟缺血再灌注乳鼠心肌细胞的凋亡

目的：探讨促凋亡蛋白Bid在模拟缺血再灌注乳鼠心肌细胞凋亡中的作用及其可能的机制。方法：培养出生1～3 d的SD乳鼠心肌细胞,随机分为正常对照组、模拟缺血再灌注组、模拟缺血再灌注+无关siRNA组、模拟缺血再灌注+Bid特异siRNA组。各组心肌细胞经缺氧2 h,复氧4 h建立缺血再灌注损伤模型;脂质体转染法（Oligofectamine）转入Bid无关的siRNA及Bid特异的siRNA,转入Bid特异的siRNA以拆除Bid基因的表达;免疫印迹技术（Western blotting）检测心肌细胞中Bid及caspase-8的活化;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测心肌细胞的凋亡率。结果：模拟缺血再灌注时心肌细胞Bid及caspase-8被活化。转染Bid特异siRNA组的心肌细胞caspase-8的活化较模拟缺血再灌注组及转染无关siRNA组均明显减少,心肌细胞凋亡率(7.4%)较模拟缺血再灌注组(51.2%)及转染无关siRNA组(48.7%)明显降低(P<0.01),而与正常对照组凋亡率接近(4.6%)。结论：促凋亡蛋白Bid介导了模拟缺血再灌注时心肌细胞的凋亡。     

Ghrelin 预处理对 H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的：探讨 Ghrelin 预处理对 H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法培养 H9C2心肌细胞并建立心肌细胞缺氧(21 h)/复氧(6 h)模型。细胞随机分成4组：对照组,缺氧/复氧组(H/ R 组),缺氧/复氧+ Ghrelin 组(H/ R +G 组),缺氧/复氧+ Ghrelin +生长激素促分泌素受体(GH-SR)-siRNA 组(H/ R + G + G-siRNA 组);采用 siRNA 干扰技术阻断 Ghrelin 受体 GHSR 的表达以及 Hoechst 33258染色剂和流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot 法检测各组凋亡相关蛋白表达情况。结果 GHSR 存在于正常H9C2心肌细胞中,GHSR-siRNA 可以显著抑制 H9C2心肌细胞中 GHSR 的表达。与 H/ R 组相比,在 H/ R + G 组中缺氧/复氧损伤所导致心肌细胞的凋亡率明显下降(P <0．05),B淋巴细胞瘤-2蛋白/ Bcl-2相关 X 蛋白(Bcl-2/ Bax)比率明显上调(P <0．05),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)表达水平被显著抑制(P <0．05)。而与 H/ R + G组相比,H/ R + G + G-siRNA 组心肌细胞凋亡率增加( P <0．05),Bcl-2/ Bax 比率显著下降(P <0．05),caspase-3表达上调(P <0．05)。结论 Ghrelin 具有减轻缺氧/复氧所引起的心肌细胞损伤、抑制心肌细胞凋亡的作用。     

RNA干扰抑制DLL4基因表达对低氧诱导的脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管型形成的影响

研究背景： Delta-like 4 (DLL4)是近年新发现的可由低氧诱导的血管生长调控因子,属特异性表达于血管内皮细胞上的NOTCH受体的配体。最近研究表明DLL4/NOTCH信号在生理性和病理性血管新生过程中起着关键的调控作用,它可抑制新生血管的分支和出芽并促进血管的正常分化,从而阻止过度的血管新生。脉络膜新生血管(CNV)实际上也是一种有低氧参与的病理性血管新生的过程,但DLL4基因在CNV形成中的表达和作用目前报道甚少,本文研究拟在体外细胞水平观察DLL4基因在低氧培养的脉络膜血管内皮细胞中的表达规律,并通过RNA干扰技术抑制DLL4基因表达,进而评估DLL4基因对低氧诱导的脉络膜血管内皮细胞在血管新生中的生物学行为包括增殖、迁移和管型形成能力的影响。 研究方法： 以参与CNV形成的主要细胞--脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A细胞系）作为研究DLL4基因在CNV中表达和作用的体外细胞模型。通过200uM CoCl2化学诱导产生的低氧来模拟CNV体内的低氧环境。分别利用RT-PCR、real-time quantitative PCR和Western blot方法定性和定量检测低氧诱导下的RF/6A细胞中DLL4基因mRNA和蛋白水平的时程表达规律。设计和化学合成靶向DLL4基因的siRNA序列,lepofectamine 2000介导DLL4 siRNA转染低氧培养12h的RF/6A细胞。利用流式细胞仪检测荧光标记的siRNA的转染效率。分5组①空白对照组;②转染液对照组;③100nmol/l DLL4 siRNA scrambled 阴性对照组;④100nmol/l DLL4 siRNA-duplex1;⑤100nmol/l DLL4 siRNA-duplex2检测RNA干扰后的DLL4 mRNA和蛋白的表达水平,筛选RNA干扰抑制效率高的DLL4 siRNA-duplex用于转染低氧诱导的RF/6A细胞。进一步观察siRNA特异性干扰DLL4基因表达对DLL4-NOTCH-HES1-HEY1信号级联反应下游的关键靶基因HES1和HEY1 mRNA表达的调控。通过MTT和流式细胞周期分析技术观察RNA干扰抑制DLL4基因表达对低氧诱导的RF/6A细胞增殖能力的影响;利用transwell小室的体外细胞跨膜迁移实验,检测下调DLL4基因表达对低氧诱导的RF/6A细胞迁移能力的影响;通过Matrigel体外管型形成实验观察RNA干扰后的RF/6A细胞在低氧培养下形成小管样结构的长度,以反映细胞体外管型形成能力的变化。 研究结果：RF/6A细胞中可检测到DLL4基因的表达,且受低氧因素的诱导调控。低氧培养1h后,DLL4 mRNA和蛋白的表达水平逐渐增高,低氧培养12h时表达水平达到最高峰并持续高表达至24h。相对于DLL4 siRNA scrambled 阴性对照组,DLL4 siRNA-duplex1和DLL4 siRNA-duplex2转染RF/6A细胞 48小时后低氧培养12h,DLL4基因的mRNA表达抑制率分别为91.4％和82.5％,DLL4蛋白的表达抑制率分别为86.2％和75.3％。空白对照组、转染液对照组和DLL4 siRNA scrambled 阴性对照组三组之间的DLL4基因表达水平无显著性差异(P=0.139),DLL4 siRNA-duplex1能特异性抑制DLL4基因表达。HES1和HEY1的mRNA表达水平也相应分别下降75.1％ (P=0.004)和86.3％ (P=0.004),表明DLL4基因具有调控DLL4-NOTCH-HES1-HEY1信号级联反应的作用。 MTT结果显示：siRNA转染48h的RF/6A细胞继续低氧培养72h和96h的吸光度（A）值较scrambled 阴性对照组明显增加(P=0.031, P=0.006), 且相应的细胞周期分析显示RF/6A细胞阻滞在S期;转染DLL4 siRNA-duplex1的RF/6A细胞低氧培养8h后,迁移过膜的细胞数明显增多,为scrambled 阴性对照组的1.6倍,其细胞数差异具有统计学意义 (P<0.001)。空白对照组、转染液对照组和DLL4 siRNA scrambled 阴性对照组之间的跨膜迁移细胞数无显著变化 (P=0.137)。转染DLL4 siRNA scrambled negative control的RF/6A细胞低氧培养24h后在体外Matrigel上多形成条索状或不连续且稀疏的小管样结构,而转染DLL4 siRNA-duplex1的RF/6A细胞可形成环形完整的网状小管样结构,且管型长度明显增加了82.3％,其差异有统计学意义 (P<0.001)。空白对照组、转染液对照组和DLL4 siRNA scrambled 阴性对照组之间的管型长度则无明显差异(P=0.178)。 研究结论：DLL4是受低氧诱导的新生血管分支和出芽的负性调控因子。靶向DLL4基因的siRNA可抑制低氧培养的RF/6A细胞中DLL4、HES1和HEY1基因的表达水平,并促进RF/6A细胞体外增殖、迁移和管型形成。DLL4可望成为脉络膜新生血管治疗策略中的新靶点。     

NEDD4调控AMPK活性参与心肌细胞慢性缺氧适应的研究

目的 探讨NEDD4在心肌细胞慢性缺氧适应过程中的作用及其可能的机制.方法 ①收集手术矫正的先心病患儿32例,其中紫绀型先心病18例,非紫绀型先心病14例.取术中切除的右室流出道心肌组织作为标本,用免疫组化染色检测NEDD4在心肌细胞中表达的分布,Western blot检测NEDD4在心肌组织中的表达情况;②将H9c2心肌细胞分为常氧组、慢性缺氧组和阳性对照组,其中慢性缺氧组又分为对照组、空白转染组和干扰转染组,设计合成以心肌细胞NEDD4基因为靶标的siRNA,通过阳离子脂质体将合成的siRNA转染至H9c2心肌细胞中,常氧培养(74％ N2,5％ CO2,21％O2)48 h后开始对慢性缺氧组心肌细胞进行缺氧刺激(94％ N2,5％ CO2,1％ O2),缺氧刺激72 h后Western blot检测NEDD4、p-AMPK表达水平变化,流式细胞术检测缺氧刺激所致心肌细胞损伤情况.结果 ①紫绀组患儿术前血氧饱和度明显低于非紫绀组(P＜0.05);免疫组化染色结果显示NEDD4主要分布于心肌细胞质中;与非紫绀组相比,紫绀组患儿心肌组织中NEDD4表达水平显著下降[NEDD4/β3-actin条带灰度比值:非紫绀组(0.72±0.07);紫绀组(0.42±0.06),P＜0.05];②与常氧组相比,对照组心肌细胞死亡比例显著增加(P＜0.05);但干扰NEDD4表达后,缺氧所致心肌细胞损伤比例降低(P＜0.05).Western blot检测结果显示,与空白转染组相比,干扰转染组AMPK磷酸化水平显著增加[p-AMPK/AMPK条带灰度比值:空白转染组(0.21±0.01),干扰转染组(0.88±0.04),P＜0.05].结论 NEDD4可能通过调控AMPK活性参与慢性缺氧情况下心肌细胞代谢的适应调节.     

Effects of UbcH10 gene silencing combined with paclitaxel treatment on proliferation and apoptosis of NCI-H226 cells

目的 观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响.方法 化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照.以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组.结果 Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P＜0.01).MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P＜0.05).siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P＜0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性.