含绿色荧光蛋白和PLCZ的逆转录病毒载体的构建及其在SHG44细胞中的表达

目的构建含有PLC-γ1分子Z区(PLCZ)和绿色荧光蛋白基因的双顺反子逆转录病毒载体,并将其导入SHG44胶质瘤细胞中,以探索PLC-γ1分子对胶质瘤细胞侵袭作用的影响. 方法 PCR法扩增PLCz基因,测序后克隆入pIRES-EGFP荧光蛋白表达载体中,酶切鉴定重组体. 将PLCz-IRES-EGFP片段克隆入逆转录病毒载体pLXSN的相应位点,构建含有PLCz和EGFP基因的逆转录病毒载体,脂质体介导下转染包装细胞PA317,G418筛选并检测病毒滴度后挑选细胞克隆. 病毒上清感染人脑胶质瘤SHG44细胞,G418筛选获得稳定转染细胞,PCR检测外源基因的整合,Northern blot检测外源基因的转录,Western blot和荧光显微镜分别检测PLCz分子和EGFP的表达. 结果 PCR扩增得到大小约650 bp的特异性条带,序列测定结果与发表序列一致. 构建得到含有PLCz和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒载体,转染人脑胶质瘤细胞SHG44,得到稳定转染的细胞株SHG44-PIE. PCR扩增显示目的片段已整合入细胞基因组. Northern blot分析显示为单一的转录本. Western blot可见大小约50×103的特异性条带,荧光显微镜检测显示EGFP获得良好表达. 结论成功构建含有PLCz和绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体,并获得稳定转染该载体的SHG44胶质瘤细胞株.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

ED-L2-LMPl-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鏊定EB病毒LMPl基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体.方法 应用DNA重组技术,将EB病毒ED-L2启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上,筛选阳性克隆,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后,以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和带目的 基因ED-L2-LMP1-EGFP载体共同转染到293FT包装细胞内包装病毒,荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况,收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度.PCR和免疫组化鉴定LMP1表达.结果 融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782 bp的ED-L2和1 300 bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒栽体中.转染重组ED-L2-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光;对该细胞PCR可以扩增出404 bp大小的LMP1基因片段和370 bp的EGFP基因片断;免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性.结论 成功构建了ED-L2-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体,为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础.     

ED-L2-LMP1-EGFP融合基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建及鉴定EB病毒LMP1基因和增强型绿色荧光蛋白基因融合慢病毒表达载体。方法应用DNA重组技术，将EB病毒ED-12启动子和LMP1基因克隆到带有EGFP基因的FUGW慢病毒表达载体上，筛选阳性克隆，经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组载体后，以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8．9、包膜基因VSVG和带目的基因ED-12-LMP1-EGFP载体共同转染到293FF包装细胞内包装病毒，荧光显微镜下观察包装细胞报告基因表达情况，收集病毒上清、浓缩鉴定、测定重组病毒的滴度。PCR和免疫组化鉴定LMP1表达。结果融合慢病毒表达载体质粒限制性酶切分析证实有782bp的ED-12和1300bp的LMP1基因片段基因片段插入到慢病毒载体中。转染重组ED-12-LMP1-EGFP慢病毒融合载体的细胞于荧光显微镜下呈绿色荧光；对该细胞PCR可以扩增出404bp大小的LMP1基因片段和370bp的EGFP基因片断；免疫组化证明LMP1蛋白在转染细胞表达阳性。结论成功构建了ED-12-LMP1-EGFP基因的慢病毒表达载体，为进一步在体研究LMP1基因的功能奠定了基础。     

GDNF表达载体的构建及其转染STO细胞的研究

目的：制备过表达GDNF的转基因 STO 细胞,用于富集精原干细胞。方法：构建 GDNF、EGFP 双顺反子表达载体,采用XhoⅠ、SspⅠ酶切法鉴定重组质粒,用脂质体介导法将质粒转入STO细胞,经G418抗性筛选后,分离扩增培养表达绿色荧光蛋白的抗性细胞,采用PCR法鉴定转基因细胞。结果：成功构建重组GDNF表达载体,将其转染STO细胞后,能够稳定整合到细胞染色体中,获得了表达绿色荧光蛋白的转GDNF基因STO细胞。结论：通过构建表达载体,制备GDNF转基因STO细胞,为富集精原干细胞的研究奠定了基础。     

携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法：利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达。结果：PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论：成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。     

巨细胞病毒和猴空泡病毒40启动子在中国仓鼠卵巢细胞中驱动基因表达效率比较

目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将表达载体质粒分别转染CHO-K1细胞,倒置荧光显微镜观察转染后CHO-K1细胞中EGFP的表达情况;流式细胞术检测EGFP的荧光强度,以比较2种启动子驱动外源基因表达的效率。结果 2种启动子均能够驱动EGFP在CHO-K1细胞中表达。转染质粒pWTY-02的CHOK1细胞的平均荧光强度明显高于转染质粒pWTY-03的CHO-K1细胞(P<0.05)。结论 CMV启动子在CHO-K1细胞中驱动EGFP的表达效率较高,为后续CHO表达系统中提高外源基因表达效率启动子的选择提供了依据。     

增强型绿色荧光蛋白转染对大鼠骨髓间充质干细胞体外神经元样细胞分化的影响

目的:利用质粒载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells-rMSC),研究EGFP对rMSC体外诱导分化神经元样细胞的影响.方法:以质粒为载体将EGFP基因转染rMSC,流式细胞...     

Peroxiredoxin2基因RNAi慢病毒载体构建及对SW480细胞增殖的影响

目的：构建Peroxiredoxin2（PRDX2）基因RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒表达载体,探讨PRDX2基因干扰后对结直肠癌SW480细胞增殖的影响。方法设计、合成靶向PRDX2的RNA干扰的序列,构建pGC‐EGFP‐shPRDX2慢病毒载体并进行鉴定,同时应用qRT‐PCR和Westernblot方法观察转染的SW480结肠癌细胞PRDX2mRNA和蛋白表达的抑制效果,并通过MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖变化。结果成功构建PRDX2基因慢病毒载体并经测序证实;pGC‐EGFP‐shPRDX2可有效抑制结直肠癌SW480细胞PRDX2的表达,感染慢病毒的SW480细胞中PRDX2mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0．05）;SW480细胞经PRDX2RNA干扰后其生长和增殖能力显著降低（P＜0．05）。结论PRDX2基因RNAi慢病毒表达载体在SW480细胞中表达稳定可靠,PRDX2基因干扰后有效抑制了结直肠癌SW480细胞的增殖和生长,为进一步探讨PRDX2在结直肠癌发生、发展及转移中的作用奠定基础。     

人内皮细胞一氧化氮合酶红色荧光蛋白报告基因载体的构建与表达

目的：研究血管壁切应力诱导的人血管内皮细胞内皮细胞-氧化氮合酶（eNOS）基因表达的调控机制,构建在哺乳动物细胞中表达的eNOS红色荧光蛋白报告基因载体。方法：从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子,将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRedl-l上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后将重组载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达和分布情况。结果：PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDseNOSRed的构建正确,该载体能在293细胞中高效表达。由eNOS启动子驱动表达的红色荧光蛋白大部分均匀分布于整个细胞中,转染后12h开始出现,36-48h为表达高峰,120h后红色荧光几乎全部消失。结论：成功构建了eNOS红色荧光蛋白报告基因载体,该载体能在哺乳动物细胞中高效表达,为研究血管壁切应力诱导血管内皮细胞eNOS基因表达的调控机制提供了一个重要而又方便的工具。     

人自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因克隆与鉴定

目的：P58．2基因克隆与鉴定。方法：采用RT—PCR技术，从正常人外周血单个核细胞中扩增自然杀伤细胞抑制性受体P58．2基因全长cDNA，经酶切后构建重组克隆载体，双酶切和测序鉴定。结果：RT—PCR获得了预期的扩增产物P58．2全长cDNA，成功构建了pSPORT1-P58．2重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58．2cDNA全长碱基序列一致。结论：pSPORT1-P58．2重组克隆载体构建成功；P58．2基因序列与文献报道一致，为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。     

可溶性血管内皮细胞生长抑制因子基因的克隆与表达

目的：对可溶性人血管内皮细胞生长抑制因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＶＥＧＩ）基因进行克隆和表达,检测表达产物对血管内皮细胞增殖的抑制活性。方法：将可溶性人ＶＥＧＩ基因克隆入载体ｐＵＣ１９后测序;再将正确的ＶＥＧＩ基因亚克隆入表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴｂ,ＩＰＴＧ诱导表达;初步纯化表达产物,检测对新生牛主动脉内皮细胞增殖抑制活性。结果：可溶性人ＶＥＧ     

人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达

目的：构建牛乳头瘤病毒晚期基因L1-GFP融合基因真核表达质粒，自细胞水平探讨优化密码对晚期基因L1蛋白瞬时表达的影响。方法：用PCR方法扩增获得优化密码人源化BPVL1(hL1)基因。TA克隆后，酶切释放hL1基因，定向插入质粒pET30a／NM-GFP的BamHⅠ、SacⅡ位点，获得正确框架的hL1-GFP融合基因。再用BamHⅠ、NotⅠ酶切释放hL1-GFP融合基因，与pcDNA3载体定向重组构建真核表达质粒pcDNA3／hL1-GFP。同法克隆获得含野生型BPVL1-GFP融合基因的表达质粒pcDNA3／wL1-GFP。用质粒DNA分别在体外转染哺乳动物细胞COS-1细胞和Wish细胞，荧光显微镜下观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况。结果：酶切鉴定表明成功构建了含wL1-GFP、hL1-GFP的真核表达栽体，与pcDNA3／wL1-GFP相比，pcDNA3／kL1-GFP在COS-1细胞、WISH细胞中获得有效表达。结论：优化密码能提高乳头瘤病毒L1基因在哺乳动物细胞内的蛋白表达。     

nm23-H1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建包含人野生型nm23-H1cDNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pLXSN-nm23-H1-EGFP，用以研究nm23-H1逆转肺癌转移表型的分子机制。方法：应用基因工程和分子克隆技术，将nm23-H1-EGFP基因克隆到真核表达载体pLXSN中，得到真核重组载体pLXSN-nm23-H1-EGFP；脂质体法转染包装细胞系PA317，得到包含nm23-H1-EGFP的逆转录病毒，并感染人肺癌细胞株L9981。结果：构建了pLXSN-nm23-H1-EG-FP逆转录病毒真核表达载体，L9981细胞能够表达nm23-H1-EGFP融合蛋白。结论：成功构建真核表达载体pLXSN-nm23-H1-EGFP，并能在L9981细胞中持续、稳定和高效表达nm23-H1-EGFP融合蛋白。     

DEC1基因真核表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖的影响

目的构建人分化型胚胎软骨发育基因DEC1真核表达载体,探讨DEC1基因对胃癌细胞增殖的影响。方法提取人胃癌细胞MGC-803总RNA,RT-PCR扩增获得DEC1基因,将DEC1基因插入pGEM-T载体,再插入真核表达质粒pcDNA3,将成功构建的pcDNA3-DEC1载体介导转染MGC-803细胞。通过RT-PCR和Westernblot分别检测转染后细胞DEC1在mRNA和蛋白水平的表达;MTT法、免疫细胞化学法检测过表达DEC1基因后MGC-803细胞增殖的变化。结果转染pcDNA3-DEC1质粒的MGC-803细胞DEC1 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05);MTT试验、ki-67免疫细胞化学染色显示转染后细胞增殖能力明显升高(P<0.05)。结论 DEC1的过表达能明显增强胃癌细胞MGC-803的增殖能力。     

RNA干扰PCGF4/Bmi-1抑制白血病K562细胞系增殖

目的:利用RNAi方法针对PCGF4/Bmi-1基因,抑制其在慢性髓性白血病K562细胞中的过表达,观察K562细胞的增殖性改变。方法:RT-PCR检测PCGF4/Bmi-1基因在K562中的表达情况。利用Invitrogen公司RNAi慢病毒表达载体系统,构建针对PCGF4/Bmi-1基因慢病毒RNAi表达载体。转染K562细胞,瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的表达,实时定量PCR检测干扰前后基因表达变化。利用生长曲线测定干扰载体转染前后细胞生长速度变化。结果:PCGF4/Bmi-1慢病毒RNAi表达载体成功地构建,并建立瞬时干扰PCGF4/Bmi-1基因的K562细胞系。实时定量PCR检测,PCGF4/Bmi-1基因在K562细胞系中过表达被显著抑制。生长曲线测定,PCGF4/Bmi-1基因干扰后细胞增殖明显变慢。结论:干扰PCGF4/Bmi-1基因,降低该基因表达后能明显减低细胞的生长速度。     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

反义细胞周期D1蛋白抑制肾小球系膜细胞增殖研究

目的探讨细胞周期蛋白（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１在肾小球系膜细胞增殖机制中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白在系膜细胞内表达;建立了表达ＣｙｃｌｉｎＤ１反义ＲＮＡ的逆转录病毒载体基因转移系统;利用ＭＴＴ法、流式细胞术对基因转录的系膜细胞的增殖状况进行观察。结果（１）体外培养的系膜细胞核内存在ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白;（２）外源基因经逆转录病毒载体高效转导系膜细胞,并高效表达反义ＲＮＡ;（３）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１转导后的系膜细胞对内皮素１刺激的增殖反应不明显,而正常细胞（１８小时０２５９±００８０,６小时０１００±０００７）和空载体转导细胞（１８小时０２７８±００２０,６小时００９７±０００８）有显著效应（Ｐ＜００１）;（４）反义ＣｙｃｌｉｎＤ１抑制细胞从Ｇ１期进入Ｓ期。结论ＣｙｃｌｉｎＤ１是肾小球系膜细胞周期Ｇ１期进展的关键调控蛋白,反义ＣｙｃｌｉｎＤ１基因转导系膜细胞能明显抑制内皮素１的促增殖作用。