不同样品制备方法对双向电泳图谱的影响

【目的】探索体外培养星形胶质细胞双向电泳样品制备方法,提高电泳分辨率和重复性。【方法】分别应用直接裂解法和TCA-丙酮沉淀法制备蛋白样品,比较各提取方法对电泳图谱的影响。【结果】TCA-丙酮沉淀法所制备的蛋白样品,电泳图谱所获蛋白斑点数目较多,斑点较清晰,分辨率较高,重复性较好。【结论】TCA-丙酮沉淀法更适于制备体外培养星形胶质细胞双向电泳蛋白样品。     

双向电泳中人血清蛋白样品不同处理方法的比较

目的针对人血清双向电泳流程中样品制备的不同方法,本研究进行了系统的比较和分析。方法采用丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白纯化试剂盒,去白蛋白及免疫球蛋白试剂盒预处理血清样品;双向电泳分离;硝酸银染色;软件分析所得蛋白质斑点。结果对丙酮沉淀法,三氯醋酸沉淀法,三氯醋酸/丙酮沉淀法,蛋白纯化试剂盒处理血清所得到的2 DE图谱统计分析,得到平均蛋白质点数分别为1?802±12,1?648±10,1?727±13,1?670±14;对去除白蛋白及免疫球蛋白血清所得到的双向电泳（2 DE）图谱与丙酮沉淀血清所得到的图谱进行统计,得到平均蛋白质点数分别为1?212±16,1?258±12,并对其中差异蛋白进行了质谱鉴定。结论结果表明不同血清沉淀方法对血清的双向电泳各有优劣;血清去除白蛋白及免疫球蛋白之后,可以提高一些低丰度蛋白的检出,但会导致部分蛋白的丢失。     

适用于小鼠肝组织蛋白质组分析的样品制备方法

目的建立适用于小鼠肝组织蛋白质组分析的样品制备方法。方法在样品制备过程中联合应用了蛋白酶抑制剂EDTA和PMSF，加入了去除核酸影响的DNase Ⅰ和RnaseA。结果通过对样品制备条件的优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论我们采取的方法具有较高的分辨率和重复性，为进一步实验打下良好基础。     

大鼠皮质双向电泳样品制备方法的优化

目的 优化大鼠皮质双向电泳样品制备方法．初步建立双向电泳条件．提高电泳分辨率和重复性。方法 分别应用三氯乙酸／丙酮沉淀法、超速离心法及改良超速离心法制备电泳样品．并比较各处理方法对电泳的影响。改良超速离心法即将混合了匀浆液Ⅱ的匀浆物4C放置过夜后再进行后续处理。结果 改良超速离心法所制备的电泳样品．不仅可以减少蛋白的降解．还可以增加蛋白的溶解性．从而获得分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱。结论 改良超速离心法更适于制备来源于中枢神经系统双向电泳样品。     

鱼腥草叶片总蛋白的提取及双向电泳体系的建立

[目的]比较鱼腥草叶片蛋白质提取方法,建立适用于鱼腥草蛋白质组双向电泳分析方法.[方法]以鱼腥草叶片为材料,分别采用凯基试剂盒、三氯乙酸/丙酮沉淀法、尿素/硫脲提取法及酚法4种方法提取鱼腥草叶片总蛋白,使用Bradford 法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)分析,所得2-DE凝胶图片采用PDQuest软件进行分析.[结果]4种方法的提取率分别为2.90、2.55、3.90、3.80 mg/g,分别检测到186、153、356、315个蛋白点,酚法提取蛋白质的2-DE图谱效果较好,结果的重复性较好.[结论]不同方法提取鱼腥草叶片总蛋白的2-DE结果存在差异,以酚法提取的2-DE效果较好,适用于鱼腥草叶片蛋白质组分析.     

大鼠胰腺蛋白质组研究中双向电泳技术的初步建立

目的：初步建立大鼠胰腺蛋白质组研究中双向电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法：应用大鼠成年和胚胎18天胰腺组织提取的总蛋白，对以载体两性电解质pH梯度为第一向的双向电泳关键因素与环节，如样品处理、凝胶制备、电泳参数等进行一系列的优化。结果：获得了分辨率及重复性均很好的双向电泳图谱。结论：通过对各种条件的优化，初步建立了双向电泳技术，为研究胚胎胰腺不同时期特异性蛋白的表达及分子标志打下基础。     

黏细菌总蛋白质组双向电泳条件的建立

目的 :建立可以对黏细菌蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法 :以黏细菌模式菌株DK162 2为材料 ,不同方法制备DK162 2在营养性生长阶段的蛋白质组样品 ,双向电泳阵列菌体总蛋白。通过不同条件下电泳图谱的比较建立蛋白质组样品的制备方法和双向电泳的技术条件。结果 :两性离子去污剂CHAPS及还原剂的浓度是影响双向电泳图谱分辨力的重要因素 ;蛋白质组样品的处理必须在低温下快速完成 ,以避免蛋白降解。结论 :初步建立了黏细菌总蛋白质组的双向电泳条件 ,为在细胞水平分析该模式生物发育时期蛋白表达谱奠定了基础     

大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究

目的 :建立一种成骨细胞的体外培养方法 ,并研究不同培养时期成骨细胞的生物学特性。方法 :选用成年雌性大鼠松质骨为培养细胞来源 ,组织块培养法和胰酶消化法相结合进行成骨细胞培养 ,并测定成骨细胞不同培养阶段的碱性磷酸酶 (AKP)活性和骨钙素 (OC)分泌水平。结果 :体外培养所获成骨细胞纯度高、数量多 ,且培养时间明显缩短。培养细胞近融合时 ,产生的AKP和OC处于低水平 ,融合后 3d、14dAKP和OC的产生明显增加。结论 :实验采用的改良大鼠成骨细胞培养方法较为方便、切实可行。体外培养的大鼠成骨细胞在不同生长阶段 ,其骨基质蛋白的产生发生相应变化     

益骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞分泌IGF-Ⅰ的影响

目的 :观察益骨胶囊对体外培养成骨细胞增殖和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )的影响 ,探讨该方的作用机制。方法 :分离、培养新生大鼠的原代成骨细胞 ,采用MTT法测定含药血清作用后的成骨细胞增殖和分泌IGF Ⅰ的量。结果 :益骨胶囊含药血清中、高剂量组成骨细胞增殖和分泌IGF Ⅰ的量均明显高于对照血清组 (P <0 .0 1)。结论 :益骨胶囊具有促成骨细胞增殖和分泌IGF Ⅰ的作用 ,可能是该方防治骨质疏松的机制之一     

正常大鼠脊髓蛋白质组学实验研究

目的调整和优化实验条件,建立正常大鼠脊髓蛋白组学双向电泳体系。方法取正常大鼠腰部脊髓,运用BIO-RAD PROTEAN IEF Cell加垂直SDS-PAGE BIO-RAD PROTEANRⅡXi Cell,进行等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果采用不同的聚焦条件,获得了较清晰的大鼠脊髓蛋白质2-DE谱。根据标准蛋白的回归方程,在正常脊髓的2-DE图中,清晰获得大约800多个蛋白点的等电点和分子量信息。结论在大鼠脊髓蛋白组学双向电泳过程中,样品的制备和实验条件得到进一步优化。初步获得正常大鼠脊髓蛋白组学信息。     

白念珠菌总蛋白质组二维电泳条件的建立和优化

目的:建立并优化白念珠菌总蛋白质组分析的二维电泳条件.方法:以白念珠菌国际标准菌株SC5314为材料,制备其总蛋白质组样品.以真菌细胞破碎方法、裂解液成分、上样量、固相pH梯度胶条的选择为侧重点,通过不同条件下电泳图谱的比较建立最佳二维电泳技术条件.结果:成功建立白念珠菌总蛋白质制备方法,优化了白念珠菌蛋白质组分析的二维凝胶电泳技术,获得重复性和分辨率都较理想的白念珠菌总蛋白质二维电泳图谱.结论:优化后的二维电泳条件符合白念珠菌的特点,为白念珠菌蛋白质组分析奠定基础.     

人支气管上皮蛋白质样品制备方法及其癌变各阶段组织2-DE图谱的建立

目的： 改良、优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变过程各阶段组织的2-DE图谱,为识别鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法：收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaetic acid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster 2D软件分析双向电泳图谱。结果：应用改良的DOC-TCA法提纯的支气管上皮总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱。正常上皮、鳞状化生、不典型增生和浸润癌4种组织凝胶的蛋白质点数依次为1 190±63,1 227±69,1 272±71,1 326±82。选取同例鳞状上皮化生组织进行3次重复性检测,3块凝胶的平均蛋白质点数为1 216 ±75 ,平均匹配点数为1 082±67,匹配率达 89.3% , 且3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.835±0.247） mm ,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.921±0.104） mm。结论：改良的DOC-TCA沉淀法是一种较好的支气管上皮组织蛋白质样品制备法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人支气管上皮癌变各阶段组织的双向凝胶电泳图谱。     

人角质形成细胞蛋白质双向电泳技术的建立和优化

目的 建立和优化人角质形成细胞蛋白质组研究样品制备方法和双向电泳技术条件.方法 体外无血清培养人角质形成细胞,以裂解液成分、上样量的选择和等电聚焦参数为侧重点,通过比较分析不同条件下电泳图谱,建立最佳双向电泳技术条件.结果 成功建立了人角质形成细胞总蛋白制备方法,优化了人角质形成细胞双相电泳技术,获得了重复性和分辫率都较理想的角质细胞总蛋白质双向电泳图谱.结论 优化后的双相电泳条件为人角质形成细胞蛋白质组学分析奠定基础.     

双向凝胶电泳分析脾脏蛋白组学的方法研究

目的优化双向凝胶电泳的实验步骤,总结一套适用脾脏组织的双向凝胶电泳技术。方法对双向电泳实验中的关键环节：蛋白沉淀方法;胶条PH的选择;聚焦条件等进行研究与优化,考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像比较。结果Cleaningup沉淀蛋白,聚焦电压达到11000伏小时（110kvhs）,可以得到多达1000个蛋白点的2Dgel（two—dimensionalpolyacrylamidegel）。结论建立了脾脏双向电泳的具体方法,得到分辨率高重复性好的2Dgel,为脾脏的蛋白质组学研究奠定了基础。     

两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳分离效果的影响

目的 评价两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)分离效果的影响,建立高分辨率、高重复性的血清2-DE图谱,为鉴定疾病相关血清蛋白质奠定基础.方法 分别用热SDS法和直接溶解法处理大肠癌血清样品,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白质,图像软件分析后,对其中3个差异蛋白质点行基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱鉴定.结果 应用热SDS法处理血清总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人血清双向电泳图谱.对直接溶解和热SDS法处理的蛋白样品进行3次重复性检测,凝胶的平均蛋白质点数为675±46和702±49,平均匹配点数为573±42和623±52,匹配率为85.3%和89.6%,分析3块不同胶间蛋白质点在IEF方向的位置偏差为(0.85±0.30)mm和(0.81±0.28)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.02±0.18)mm和(0.97±0.12)mm.热SDS处理的2-DE胶蛋白质点质谱可获得高质量质谱图,并可以检测到相对低丰度的血清蛋白质.结论 热SDS法是一种更有效的血清蛋白质样品制备方法,我们利用热SDS法处理血清样品建立了分辨率较高且重复性好的人血清蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术研究

目的：利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳技术（2-DE）建立正常精子的蛋白质图谱。方法：比较不同蛋白质提取方法和上样量、不同的第一向等点聚焦方法所得图谱的差别,并初步建立人类正常精子的蛋白质图谱。结果：用蛋白质提取方法一制得的样本电泳后有670-703个蛋白质斑点;方法二所得样本电泳后仅有194-210个蛋白质斑点。蛋白质提取方法一所制样本进行载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）得到约280-300个蛋白质斑点,用固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）得到多达700个蛋白质斑点。结论：采用蛋白质提取方法一制备精子蛋白质进行IPG-DALT电泳的方法租用于建立精子全细胞蛋白质谱。     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系的建立

目的:建立大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系。方法:提取大鼠肾脏组织的样品蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化。结果:最终选择的裂解液配方是1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/LTris,8mol/L尿素,2mol/L硫脲;使用pH 4～7的IPG胶条进行被动水化上样,等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整;改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论:成功建立具有较高分辨率和重复性的大鼠肾脏组织蛋白质组双向电泳分离体系,为后续实验研究提供有力的技术保障。