抗菌肽cecropin B和兔NP-1融合基因转化鱼腥草的研究

目的:将抗菌肽cecropin B和兔NP-1(CN)融合基因转入鱼腥草,培育鱼腥草基因工程新品种。方法:设计并合成抗菌肽融合基因CN,构建重组质粒pBI121-CN,并转入农杆菌LBA4404,以农杆菌介导法转化鱼腥草外植体,将卡那霉素筛选获得的再生抗性植株以快速筛选PCR法进一步筛选阳性植株,再提取基因组DNA进行PCR-Southern鉴定,RT-PCR分析目的基因在鱼腥草中的表达,以大肠杆菌K12抑菌圈实验和立枯丝核菌感染实验分析转基因鱼腥草抗菌能力。结果:抗菌肽基因已整合到转基因鱼腥草基因组中并表达,表现出抗菌能力增强的性状。结论:以抗菌肽融合基因CN转化鱼腥草,初步获得抗菌活性提高的转基因植株。     

鱼腥草叶片总蛋白的提取及双向电泳体系的建立

[目的]比较鱼腥草叶片蛋白质提取方法,建立适用于鱼腥草蛋白质组双向电泳分析方法.[方法]以鱼腥草叶片为材料,分别采用凯基试剂盒、三氯乙酸/丙酮沉淀法、尿素/硫脲提取法及酚法4种方法提取鱼腥草叶片总蛋白,使用Bradford 法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)分析,所得2-DE凝胶图片采用PDQuest软件进行分析.[结果]4种方法的提取率分别为2.90、2.55、3.90、3.80 mg/g,分别检测到186、153、356、315个蛋白点,酚法提取蛋白质的2-DE图谱效果较好,结果的重复性较好.[结论]不同方法提取鱼腥草叶片总蛋白的2-DE结果存在差异,以酚法提取的2-DE效果较好,适用于鱼腥草叶片蛋白质组分析.     

青藤碱对肺癌细胞A549中COX2、α7nAChR和A2A表达的影响

【目的】观察青藤碱(sinomenine,SIN)对环氧化酶2(COX2)、α7烟碱型乙酰胆能受体(α7nAChR)和腺苷受体(A2A)表达变化的影响,探讨青藤碱对A549细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测青藤碱和4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)对A549细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察青藤碱和NNK对A549细胞迁移的影响;Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞COX2蛋白表达的影响;RT-PCR和Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞α7n ACh R、A2A表达的影响。【结果】NNK能促进增殖和迁移,青藤碱能抑制A549细胞增殖和迁移;NNK组COX2蛋白质水平增加,青藤碱组COX2蛋白质水平下降;NNK组α7n ACh R、A2A的表达增加,青藤碱组α7n ACh R、A2A表达下降。【结论】青藤碱能通过抑制COX2蛋白表达发挥抗A549细胞增殖和迁移作用;青藤碱对α7n ACh R和A2A受体的表达均有抑制作用。     

青藤碱对FLS增殖及α7nAChR、TLR2和TLR4表达的影响

目的探讨青藤碱(sinomenine,SIN)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激的大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖及α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptors,α7n ACh R)、Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)和Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)表达的影响。方法组织块法分离培养原代FLS,流式细胞术检测FLS表面标志物CD90。FLS设对照组、TNF-α组、SIN组(100,200,400μmol·L~(-1)),SIN组给予SIN干预30 min后,TNF-α组、SIN组均给予20 ng·m L~(-1)TNF-α刺激24 h,采用MTT法检测各组FLS增殖,酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)分泌量,RT-PCR法检测α7n ACh R、TLR2和TLR4 m RNA表达及Western bolt法检测α7n ACh R、TLR2和TLR4蛋白表达。结果 TNF-α刺激FLS后,细胞明显增殖,分泌IL-6明显增加,α7n ACh R、TLR2和TLR4 m RNA及蛋白表达增加,SIN(200,400μmol·L~(-1))能抑制FLS增殖,抑制IL-6分泌,并且下调α7n ACh R、TLR2和TLR4 m RNA及蛋白表达。结论 FLS增殖与α7n ACh R、TLR2和TLR4表达相关,且SIN能抑制FLS增殖,并下调α7n ACh R、TLR2和TLR4表达。     

农杆菌介导的抗菌肽基因转化阳春砂愈伤组织的研究

目的确定遗传转化条件,将抗菌肽CN基因转入阳春砂愈伤组织。方法以阳春砂愈伤组织为受体材料,以农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程细胞介导抗菌肽CN基因转化阳春砂,设计正交实验,通过分析gus报告基因的瞬时表达比较转化影响因素,并对目的基因CN进行PCR检测。结果农杆菌浓度、侵染时间、共培养温度、共培养时间及乙酰丁香酮浓度对转化率的影响有显著差异性。阳春砂愈伤组织遗传转化的最佳条件组合是:农杆菌浓度为OD600=0.5,侵染时间10 min,共培养温度24℃,共培养时间4 d,共培养培养基添加乙酰丁香酮200μmol.L-1。gus基因瞬时表达呈阳性的愈伤组织DNA经目的基因CN的PCR检测可见清晰的目的条带。结论建立了农杆菌介导的阳春砂愈伤组织的转化条件,目的基因CN已转入阳春砂愈伤组织。     

小檗碱对LPS、IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-10的影响

目的 观察小檗碱（Berberine,Ber）对脂多糖（LPS）以及白介素-4（IL-4）诱导的RAW264.7细胞株分泌炎症因子中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、抑炎因子白介素（IL-10）的影响,初步探讨Ber对巨噬细胞极化的影响。方法 噻唑蓝（MTT）法测定小檗碱对RAW264.7细胞增殖的影响,选取半数抑制浓度（IC50）以下的小檗碱浓度作为干预剂量;酶联免疫法（ELISA）检测小檗碱对LPS以及IL-4不同诱导状态下RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-10的影响。结果 小檗碱对RAW264.7细胞的IC50在400～800 μmol·L-1之间。LPS作用下RAW264.7细胞促炎因子TNF-α分泌量明显升高,Ber（剂量分别为5,10,20 μmol·L-1）有显著的抑制作用,并有剂量依赖关系（均P＜0.01）;而LPS刺激下细胞IL-10分泌量也明显升高（P＜0.05）,而Ber仅在20 μmol·L-1剂量下表现抑制作用。在IL-4作用下,RAW264.7细胞抗炎因子IL-10分泌量明显升高,Ber（剂量分别为5,10,20 μmol·L-1）有显著的抑制作用,并呈现剂量依赖关系（均P＜0.01）;IL-4作用下TNF-α分泌量明显降低（P＜0.05）,Ber对TNF-α分泌量的影响无剂量依赖性。结论 Ber对LPS刺激下促炎因子TNF-α的分泌具有抑制作用,对IL-4诱导下IL-10分泌量的升高也有抑制作用,提示Ber在巨噬细胞极化过程中有调节作用。     

桃红四物汤含药血清对巨噬细胞的影响

目的探讨桃红四物汤含药血清对巨噬细胞分泌TNF-α、TGF-β1功能的影响,阐述中药治疗激素性股骨头坏死的作用机制。方法普通级新西兰兔,♀♂各半,随机分为3组,每日灌服浓度为1 g.ml-1的桃红四物汤药液,高剂量组15 ml.kg-1、低剂量组7.5 ml.kg-1,对照组15 ml.kg-1的生理盐水,每日1次,连续灌胃2周;巨噬细胞以5×105接种于6孔板中,以坏死骨微粒制备模型组,并予以含药血清干预48 h,ELISA检测各组上清中TNF-α、TGF-β1的含量;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组巨噬细胞TNF-α、TGF-β1mRNA的变化。结果荧光定量RT-PCR和ELISA检测结果可见桃红四物汤含药血清作用下的巨噬细胞分泌的TNF-α的量较空白血清组降低,组间差异具有统计学意义(P<0.05);桃红四物汤含药血清作用下巨噬细胞分泌的TGF-β1在转录水平和蛋白水平较空白血清组均有明显的升高,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论桃红四物汤含药血清能提高巨噬细胞TGF-β1的表达,抑制TNF-α的表达,进而促进激素性股骨头坏死中骨的修复。     

胆碱能抗炎通路及其在中医药抗炎免疫研究中的进展

胆碱能抗炎通路（CAP）是近年发现的在神经免疫网络中发挥炎症调节作用的重要抗炎通路。α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR）是目前较明确的在CAP中发挥关键作用的受体,在免疫细胞上表达的α7 nAChR参与细胞增殖活化及炎症反应的调节,α7 nAChR已成为炎症相关性疾病的药物治疗靶标。本文综述CAP中α7 nAChR的作用机制及对免疫细胞的调节作用,并阐述中医药通过CAP发挥抗炎作用的研究现状。     

青藤碱对肺癌细胞A549增殖及α7 nAChR表达的影响

目的研究青藤碱对肺癌细胞增殖的影响及与α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nAChR)表达的相关性。方法体外培养人肺癌细胞系A549细胞,采用CCK-8法检测24,48h不同浓度青藤碱及4-甲基亚硝氨基-3-吡啶-1-丁酮(NNK)对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况;RT-PCR法检测A549细胞中α7 nAChR表达。结果0.1,0.25,0.5,1,2,3,4mmol·L-1青藤碱作用于A549细胞后,细胞增殖率随青藤碱剂量增加而降低。NNK能促进细胞增殖,降低细胞早期凋亡比例,并明显增加α7 nAChR的表达;青藤碱可明显抑制NNK的促细胞增殖作用,并提高细胞早期凋亡比例,降低α7 nAChR的表达。结论青藤碱能抑制A549细胞增殖,可能与降低α7 nAChR的表达相关。