一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA进行亚硫酸氢盐修饰.通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基凶甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果 改良法对于低至15、625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。     

胃癌细胞中BNIP3基因CpG岛甲基化及其调控作用

目的观察胃癌细胞株MKN1中BNIP3基因启动子区的甲基化状态,探讨DNA甲基化调控BNIP3表达的机制。方法应用亚硫酸氢盐修饰后克隆测序法检测MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化状态,应用甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)处理MKN1细胞,观察给药前后BNIP3 m RNA表达及启动子区Cp G岛甲基化状态的改变。应用染色质免疫沉淀技术检测BNIP3基因与DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的结合。结果 MKN1细胞中BNIP3基因启动子区呈高甲基化状态。应用5-Aza-Cd R处理细胞后,药物处理组(5-Aza-Cd R浓度为10μmol/L)和对照组甲基化率和BNIP3 m RNA表达的差异均有统计学意义(P<0.05)。5-Aza-Cd R抑制MKN1细胞中DNMT1与BNIP3基因的结合。结论 MKN1细胞中BNIP3基因表达受启动子区Cp G岛甲基化调控,DNA甲基化的发生与DNMT1和BNIP3基因结合有关。     

胃癌形成过程中端粒酶反转录酶基因表达及启动子甲基化状态分析

目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组织样本中hTERT基因表达的阳性率;用亚硫酸氢盐修饰上述各组标本DNA,然后检测修饰后的hTERT序列:启动子区CpG位点,未发生甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U);在启动子区不含CpG位点的位置,进行引物设计,然后利用PCR进行扩增。扩增产物序列与原序列比对,观察启动子区甲基化情况。结果 hTERT基因在胃癌组表达的阳性率最高,在癌前病变组表达的阳性率明显降低,而在正常胃黏膜组中不表达,3组组织样本hTERT表达阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。hTERT启动子区甲基化程度在胃癌组中最高,在胃癌前病变组中明显降低,而在正常胃黏膜中甲基化程度最低,3组组织样本hTERT启动子区甲基化程度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERT启动子区甲基化程度在正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌中依次升高,故hTERT启动子区甲基化程度的变化可作为胃癌形成过程中肿瘤早期诊断的潜在分子生物学标志。     

EC9706细胞和人食管鳞状细胞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化状态

目的:探讨人食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)MAL基因启动子区的甲基化状态。方法:利用亚硫酸氢盐测序法检测人食管鳞癌细胞系EC9706中MAL基因启动子区CpG位点甲基化的发生情况。根据测序结果选用甲基化敏感性限制性内切酶酶切结合PCR技术进一步检测26例食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织MAL基因启动子区的甲基化情况。结果:EC9706细胞中MAL基因启动子区检测出42个胞嘧啶位点的甲基化,占所有CpG位点的73.7%(42/57)。食管鳞癌组织中MAL基因的甲基化率为53.8%(14/26),远远高于配对癌旁正常组织的7.7%(2/26)(χ2=10.924,P<0.001)。不同临床病理特征食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:MAL基因启动子区的甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。     

p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用

目的：建立p16基因中CpG岛的甲基化分析方法，即甲基化特异的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）方法及其初步应用。方法：用亚硫酸氢钠修饰变性后的被测DNA，随之进行甲基化，非甲基化特异的PCR扩增。应用MSP法分析白血病患者的白细胞p16基因5'CpG岛的甲基化变异情况。结果：用加热法变性DNA，亚硫酸氢盐修饰DNA,Wizard DNA纯化树脂除盐，纯化修饰后的DNA都获得了成功，并建立了MSP分析p16基因甲基化的方法。白血病患者的白细胞p16基因的5'CpG岛有一定比2例的甲基化变异。结论：MSP是一种较为简便，敏感，且具有高度特异性的检测任何基因的CpG区域甲基化位点的分析方法。     

甲状腺乳头状癌与基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化的关系研究

目的 研究基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化水平与甲状腺乳头状癌发生的内在联系,建立基于启动子高甲基化抑癌基因的甲状腺乳头状癌早期诊断方法 。方法 收集甲状腺手术切除的组织标本共46例,其中甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）29例,结节性甲状腺肿（nodular goiter）17例。经提取DNA,设计并合成BSP引物,PCR扩增,采用亚硫酸氢盐法克隆测序（bisulfite sequencing）和Sequenom Mass ARRAY甲基化DNA定量分析法检测甲状腺乳头状癌组织TIMP3基因启动子CpG片段的甲基化水平。结果 亚硫酸盐修饰测序结果 显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织中的高甲基化克隆百分比为70％,显著高于结节性甲状腺肿的0％（P〈0．05）。TIMP3基因启动子区5个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化有呈较高的甲状腺乳头状癌特异性。Sequenom Mass ARRAY提供的单一CpG位点甲基化定量数据显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织的甲基化率均值（0．28）高于结节性甲状腺肿的甲基化率均值（0．15）,差异有统计学意义（P〈0．05）。TIMP3基因启动子3个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化率均值高于结节性甲状腺肿甲基化率,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 TIMP3基因CpG-16及CpG-17位点可能为甲状腺乳头状癌的启动子甲基化检测的关键位点,有望成为甲状腺癌早期诊断的分子标志物。     

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的：建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。方法：从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线。结果：构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品。经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0％,阳性对照标准品甲基化程度为100％,与双脱氧测序结果一致。经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1％。结论：成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法。     

改进的亚硫酸氢钠测序法检测HepG2 RASSF1A基因CpG岛甲基化状态

目的 改进亚硫酸氢钠测序法，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法 提取人肝癌细胞株HepG2基因组DNA，亚硫酸氢钠化学修饰，针对修饰后Ras相关家族1A基因（RASSF1A）启动子序列设计特异引物并结合沉降PCR扩增，T-A载体克隆、测序。结果 HepG2细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的16个CpG位点均被甲基化。结论 改进后亚硫酸氢钠测序法能明显减少非特异性扩增，提高PCR效率，更适于基因甲基化状态的检测。     

应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用?方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织?癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A 的mRNA表达情况?结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺?癌旁及癌组织中平均分别为1.79%?93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P < 0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P > 0.05)?在PANC-1细胞?胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P < 0.05),mRNA表达无变化?结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织?癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默?该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点?     

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的:了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性(SNP)检测上的差别.方法:对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应(PCR)扩增,分别对其产物进行直接测序和克隆测序.结果:在样本的检测中, PCR产物直接测序法所测序列与43～60 bp以后克隆测序相同;检出一个突变位点并与GenBank( DQ012938)发表序列一致.结论:PCR 产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法,但前者不仅特异性强,敏感度高,而且比克隆测序方法更为快速简便,节省材料.     

膀胱癌中GDF15基因启动子区甲基化检测及逆转其甲基化状态对5637膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的 检测生长分化因子15(GDF15)在膀胱癌中的甲基化状态,探讨其启动子区异常甲基化对于膀胱癌发生发展的作用.方法 应用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)联合T-载体PCR产物(TA)克隆检测人膀胱移行细胞癌细胞系5637、HT1376、KU19-19、膀胱癌组织、癌旁组织、正常组织样品中GDF15启动子区甲基化状态,并用甲基化酶抑制剂5-Aza-2-deoxycitydine(5-Aza-dc)处理5637,观察处理前后平均甲基化率的变化情况,Western blot法检测5637处理前后蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测迁移情况,Transwell法检测侵袭能力.结果 5637、HT1376、KU19-19细胞中GDF15启动子区平均甲基化率为89.29%、10.71%、8.33%,肿瘤组织、癌旁组织及正常组织分别为86.91%、9.52%、5.95%,膀胱癌组织中 GDF15启动子区甲基化率较癌旁组织和正常组织中高,差异有统计学意义(P<0.05);5-Aza-dc可以逆转5637中GDF15的甲基化状态:与处理前相比,处理组5637细胞系GDF15蛋白表达增加,增殖、迁移、侵袭能力下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 膀胱癌中GDF15基因表达与甲基化状态有关,启动子区高甲基化导致基因沉默,逆转甲基化状态可以使基因蛋白表达增加,细胞增殖、迁移、侵袭能力均降低.GDF15基因甲基化异常状态有可能成为膀胱癌诊断的潜在靶点.     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

DNA甲基化及其在宫颈癌中的研究进展

DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的第三种机制,DNA甲基化造成的基因异常对肿瘤的发生及发展有着重要的影响。DNA的甲基化的检测方法有酶切法、限制性酶切聚合酶链反应(PCR)、甲基化特异性PCR、亚硫酸盐测序、亚硫酸盐PCR-SSCP、MethyLight等。DNA甲基化在宫颈癌的早期发现、治疗以及预测肿瘤转移复发等方面均有重要的意义。     

DNA甲基化数据分析方法和软件应用

目的分析DNA甲基化芯片实验过程质量控制方法、数据统计分析要点及实验结果的验证和数据的可视化处理。方法利用文献、DNA甲基化实验数据探讨DNA甲基化研究中的方法学。结果 DNA甲基化芯片初筛异常过程应多在步骤质量控制工作中,包括DNA片段化、免疫共沉淀阳性对照的选择、去除原始扫描噪音信号和数据均一化处理。DNA甲基化芯片的结果可采用常用的甲基化特异性PCR(MSP)和甲基化测序PCR(BSP),引物设计软件包括Methprimer和Methyl Primer Ex-press。DNA甲基化芯片分析数据的可视软件为Signal map;BSP结果的可视化可采用Windows系统下的执行软件QUMA和BISMA。结论 DNA甲基化研究,应从多角度控制实验的设计和数据的产生及结果的分析。     

结核感染相关差异基因的甲基化芯片筛选及验证

目的应用甲基化芯片筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因。方法①甲基化芯片筛选:纳入9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照（年龄与性别均匹配）,分别提取人全血单个核细胞DNA并进行亚硫酸盐转化,与Illumina HD 450K Infinium MehtylationBeadChip芯片杂交,比较3组间甲基化差异基因,进行聚类分析,检测甲基化差异片段（DMRs）,对差异基因进行GO和KEGG pathway功能富集分析并与表达芯片进行联合分析,筛选结核感染相关差异基因,用于大样本验证。②大样本验证:收集活动性结核患者与健康对照各60例（年龄与性别均匹配）,分别提取人全血DNA并进行亚硫酸盐转化,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因（IFNGR2、PTPN6、CRK1、ATP6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1）进行甲基化程度检测;RT-PCR方法进行上述基因mRNA表达检测。结果活动性结核患者与健康对照相比,呈现低甲基化改变的片段占绝大部分,大部分的DMRs位于基因主体区域,其次为转录起始位点上游区域,DMRs分布最少的区域为3′UTR区。GO与Pathway功能富集结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、细胞因子调节及炎症反应等与结核病密切相关的生物过程中。待后续验证的7个结核病相关甲基化差异基因IFNGR2、PTPN6、CRK-1、ATP6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1包含32个CpG位点,其中,16个CpG位点显示出统计学差异（P<0.05）,分布于6个基因:PTPN6、WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2。发生高甲基化的基因为PTPN6,发生低甲基化的基因为WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2。SFRP1和CRK-1基因mRNA表达在活动性结核患者中显著升高。结论在结核感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,且以低甲基化变化为主。SFRP1基因和CRK-1基因mRNA在结核组中表达上调。SFRP1和CRK-1在结核病发病过程中的作用不可忽视。     

5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

目的：研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响。方法：密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞，磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养，DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷（5-azaC）处理。分别提取DNA、RNA和蛋白质。亚硫酸氢钠处理DNA，巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌，挑取克隆测序。实时定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测穿孔素mRNA的表达，Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化。结果：5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组（P〈0．05）。测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低，与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高，这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。     

副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆

目的探讨克隆副溶血性弧菌（Ｖｐ）耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用ＰＣＲ技术扩增目的基因,双酶切载体 ｐＵＣ１９和目的基因 ＤＮＡ,连接并转化大肠杆菌 ＪＭ１０９。对重组质粒进行 ＰＣＲ鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示,标准株Ｖｐｌ４－９０基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物长约６００ ｂｐ。阳性克隆的ＰＣＲ产物也为一长约６００ ｂｐ）的条带,经双 酶切可切出一约 ６００ ｂｐ的条带。 ＤＮＡ 测序结果表明与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的序列有 ９９．６５％的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Ｖｐ的保护性菌苗以及阐明Ｖｐ的致病机理奠定了基础。