人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2启动子区CpG岛的甲基化状态

目的探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中Foxa2的表达改变及其启动子区CpG岛的甲基化水平变化。方法按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞[第22代细胞,即22 PDL(populationdoubling levels,群体倍增水平)]组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组。用荧光定量PCR方法检测人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达改变,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测启动子区-777～-478 bp甲基化的变化情况,并用亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序检测启动子区域CpG岛的甲基化水平。结果与年轻细胞组比较,中年细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2 mRNA的表达水平无明显变化;而复制性衰老细胞组和早衰细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2的mRNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。早衰细胞组的启动子区具有一定的甲基化水平;年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰细胞组Foxa2启动子区CpG岛的甲基化水平分别为5.7%,17.1%和43.6%。结论人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达水平逐渐降低,其启动子区CpG岛甲基化水平逐渐升高,参与其表达调控。     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果 改良法对于低至15、625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。     

镍化合物对培养人支气管上皮细胞的致癌性研究

[目的]研究几种镍化合物对培养人支气管上皮细胞的恶性转化作用及转化细胞的致癌性。[方法]通过细胞转化、体外转化细胞的软琼脂培养和裸鼠接种 ,测定几种镍化合物的致癌性。用全谱直读感耦等离子体原子发射光谱仪检测镍转化后接种成瘤细胞及肺癌组织中二价镍离子及镉、铬、铍、砷等几种金属元素的含量。[结果]水溶性镍化合物NiCl2、Ni(CH3COO)2、NiSO4 和不溶性结晶型NiS均可使人支气管上皮细胞发生恶性转化 ,以NiS的作用最强 ,浓度为110μmol/L时 ,每瓶细胞的平均转化集落为15.7±3.51 ,而浓度大致相同的三种水溶性镍化物 (100μmol/L)的转化集落分别为7.33±3.61、6.3±2.31和5.67±1.53。转化细胞接种裸鼠后能诱发肿瘤形成。在肺癌组织中的二价镍离子浓度明显高于正常肺组织 (P<0.01) ,而NiS转化细胞内的二价镍离子浓度则相当于肺癌组织中浓度的二倍。[结论]NiCl2、Ni(CH3COO)2、NiSO4 和NiS对人支气管上皮细胞均具有转化活性和致癌性 ,此活性可能与细胞或组织内的二价镍离子浓度有关     

空调冷却水军团菌污染调查

目的 调查某市城区空调系统军团菌(Lp)污染的现状,为军团菌肺炎的预防和控制工作提供参考.方法 采取随机抽样研究方法,抽取某市城区空调冷却塔水样32份,作军团菌污染情况检测.结果 在32份冷却塔水样中,有13份水样检出了军团菌(Lp1型和Lp2-14型),其阳性检出率为41%.结论 该市空调冷却塔水军团菌污染较普遍,应当引起高度重视,加强空调系统的定期和不定期的清洗、消毒工作非常必要.     

表遗传学调控及其在外源化合物毒性分子机制中的作用

生物体内的生物信息受两种因素的调控:一种是遗传调控,另一种是表遗传调控。遗传学信息提供了生命所必需的蛋白质的模板;而表遗传学的信息提供了何时、何地和何种方式应用这些遗传学信息的指令[1]。近年来,表遗传学已成为生命科学中普遍关注的前沿。毒理学的研究揭示外源化合物     

叶绿酸抑制细胞恶性转化的蛋白表达差异分析

目的：采用蛋白质组学技术分析叶绿酸抑制细胞恶性转化的蛋白差异表达,探讨叶绿酸抗细胞转化的分子机制.方法：一步法分别提取二羟环氧苯并芘（BPDE）诱导的转化细胞B-1和叶绿酸与BPDE共处理的抗转化细胞CB-1总蛋白,应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster 2D3．10分析两种细胞的蛋白质组变化．基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点。结果：与B-1细胞相比．CB-1细胞中有47个蛋白斑点出现表达差异，其中19个蛋白斑点表达升高．28个蛋白斑点表达降低；质谱分析初步鉴定出5个差异蛋白斑点。结论：叶绿酸抑制细胞恶性转化可引起大量蛋白表达差异．这些差异蛋白可能参与了叶绿酸抗细胞转化的过程。     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA进行亚硫酸氢盐修饰.通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

细胞衰老过程中P16表观遗传学修饰研究

目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程及细胞早衰阶段中P16的表观遗传学调控作用.方法 在细胞复制性衰老过程(同步培养的22 PDL正常人胚肺成纤维细胞于约50%融合度时进行400μmol/L H2O2处理,每天用H2O2染毒工作液染毒1次,每次2 h,持续4 d)中,将正常人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞组(22 PDL)、中年细胞组(35 PDL)、复制性衰老细胞组(49 PDL);将经400μmol,L H2O2染毒4 d的22 PDL人胚肺成纤维细胞继续培养7 d,设为早衰细胞组.荧光定量PCR检测P16的mRNA表达水平,甲基化特异PCR检测其肩动子区-846～-639 bp的甲基化水平,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测其相应启动子区组蛋白修饰情况,包括组蛋白H3、H4乙酰化和H3(Lvs4)及H4(Lvs20)甲基化修饰.结果 与年轻细胞组相比,中年细胞组P16的mRNA表达降低,复制性衰老细胞组和早衰细胞组P16的mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).在P16启动子区,第一外显子上游-1 000 bp内,其CpG岛片段长度为995 bp,甲基化特异性PCR(MSP)扩增片段位于CpG岛内-84～-639 bp之间,长度为208 bp.中年细胞组、复制性衰老细胞组、早衰细胞组甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0.42、0.34、0.47,未甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0.61、0.96、0.79.在P16 IP1启动子区(-685～-489 bp),复制性衰老细胞组及早衰细胞组以组蛋白H4(Lys20)甲基化修饰为主;在P16 IP2启动子区(-229～-60bp),复制性衰老细胞组受组蛋白H3、H4乙酰化和H4(Lys20)甲基化联合修饰,早衰细胞组以H3、H4乙酰化修饰为主.结论 细胞衰老过程中,P16启动子区的组蛋白修饰联合调控其mRNA表达,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异.     

反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果改良法对于低至15．625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。