人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

人角化上皮生长因子基因(hKGF)达载体对大鼠肺泡Ⅱ型细胞增殖的影响

目的:构建人角化上皮生长因子基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为以后的hKGF基因功能和基因治疗研究提供实验材料.方法:提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增hKGF基因全长cDNA序列,经与pMD18-T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的hKGF基因cDNA全长序列插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF.载体转染后大鼠肺泡Ⅱ型细胞进行免疫细胞化学及荧光显微镜鉴定,并进行细胞记数,绘制生长曲线.结果:经RT-PCR获得609bp含限制性内切酶位点的DNA片段,T载体克隆后经双酶切、测序,确定该片段为hKGF基因cDNA,进而构建hKGF真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,经双酶切,测序确证.转染载体后,有hKGF的阳性表达并随时间逐渐增加,大鼠肺泡Ⅱ型细胞也随时间出现明显分裂增殖.结论:成功构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为进一步应用于基因治疗研究提供工具.     

肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体构建及鉴定

目的构建肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体.方法提取人肝癌组织总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因cDNA序列,经与pMD18-T simple载体连接,筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的BC047440基因cDNA序列反向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS.结果经RT-PCR获得826 bp含限制性内切酶位点的cDNA片段,T载体克隆后经PCR扩增目的片段、测序,确定该片段为BC047440基因cDNA,进而构建反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,并经PCR扩增目的片段,测序确证.结论成功构建了BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,为进一步研究该基因功能奠定了基础.通过抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织间差异表达基因进行分离、鉴定,我们发现了1条新的肝癌相关基因cDNA片断(EST)[1],长447 bp,经GenBank检索,90%与已知基因无同源性.进一步采用RACE技术,克隆出该基因的全长cDNA序列[2].经GenBank检索,与近期登录的基因BC047440同源.但该基因是从大脑组织中获得[3],而且国内外少见该基因功能研究的报道.在此基础上,本研究从原发性肝癌组织中克隆了BC047440基因的全长cDNA序列,并构建了其反义RNA真核表达载体,为进一步研究该基因功能奠定基础.     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

白细胞介素-23基因的克隆及真核双表达载体的构建

[目的]通过分别克隆白细胞介素-23（IL-23）基因的双亚基p19和p40,构建pcDNA3-IL-23真核双表达载体,为通过IL-23基因转染树突状细胞（dendritic cell,DC）增强其介导的免疫抗肿瘤作用提供基础。[方法]一步法从小鼠脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA,RT—PCR法扩增p19和p40的cDNA,扩增产物与pMD18-Tvector连接并热转化至大肠杆菌JM109,PCR法筛选阳性克隆,提取质粒并进行DNA的测序鉴定,将pMD18-p19和DMD18-p40分别限制性酶切,在对pcDNA3表达载体限制性酶切后将切胶回收的p19和p40片段分别克隆至pcDNA3．0表达载体,对阳性质粒进行XhoI/KpnI双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳分析。[结果]脾脏及胸腺中提取p19和p40总RNA电泳鉴定是完整的,克隆的p19和p40 cDNA经测序鉴定与Genebank中序列完全一致。构建的pcDNA3．0-p19和pcDNA3．0-p40质粒分别限制性酶切后得到了593bp和1028bp的基因片段;构建的pcD．NA3．0-IL-23表达载体限制性酶切后得到了1．62kbD的p19＋p40片段。[结论]成功克隆了小鼠IL-23基因,并分别构建了pcDNA3-p19、pcDNA3-p40和pcDNA3-IL-23真核表达载体,为IL-23基因转染DC来增强其免疫活性创造了条件。     

脂氧素A4受体样蛋白基因的克隆与转染及其在Hela细胞的表达

目的：构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体，克隆后转染Hela细胞，观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法：应用PCR方法．以小鼠睾丸cDNA为模板，扩增出LRLP基因片段，插入质粒pGEM—T中，转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒，经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP／LRLP，转化人大肠杆菌JM109扩增．酶切后再测序鉴定目的片段，抽提质粒后瞬时转染Hela细胞，置激光共聚焦显微镜下照像。结果：测序鉴定表明．克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100％．符合，激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论：成功地构建了真核表达载体pEGFP／LRLP，并转染了Hela细胞。     

可调控CYP4A1的逆转录病毒重组质粒的构建与鉴定

目的:运用分子生物学技术克隆CYP 4A1全长cDNA基因,进一步构建可由强力霉素诱导表达CYP4A1的逆转录病毒重组质粒。方法:运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从大鼠肝组织中扩增出CYP 4A1全长基因,克隆至pMD18-T载体,将构建正确的pMD18-CYP 4A1质粒采用双酶切亚克隆到逆转录病毒载体载体pRe-vTRE中,采用酶切反应、PCR鉴定和序列测定鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/CYP 4A1;在脂质体介导下分别将质粒pRevTRE/CYP 4A1与逆转录病毒四环素调节质粒pRevTet-on转染至包装细胞PT67,分别经抗性筛选获得稳定产生病毒的包装细胞系后收集转染后的细胞上清。用荧光定量PCR测定病毒滴度。结果:经酶切鉴定、PCR鉴定和序列测定证实成功构建了pRevTRE/CYP 4A1逆转录病毒重组质粒;转染pRevTet-on的PT67细胞病毒滴度为7.2×1010copies/L,转染pRevTRE/CYP 4A1的PT67细胞病毒滴度为5.46×109copies/L。结论:成功构建了含四环素调控CYP 4A1基因的逆转录病毒重组质粒,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为CYP 4A1基因功能及其相关疾病的研究打下实验基础。     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

1＋1〈2

两个水性不佳的年轻人在河边练习游泳，突然，他们同时听到河中心有孩子落水呼救。其中一个毫不犹豫地朝河心游去，另一个大喊“我帮你”!紧随其后奋臂追赶。     

PAI-1和ET-1在维持性血液透析患者动脉硬化中的作用

目的：探讨纤溶成分中I型纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、组织型纤溶酶原激活因子(tissue-type plasminogen activator,t-PA)与内皮素-1(endothelin-1,ET-1)在慢性肾衰竭维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者动脉硬化病变过程中所起的作用。方法：采用免疫组织化学与图像分析方法检测19例慢性肾衰竭MHD患者与11例对照组髂内动脉的血管壁病理改变与钙化程度,检测PAI-1,t-PA和ET-1在血管壁的表达情况;其中病例组按年龄分为40岁以上组(11人)和40岁以下组(8人),对照组均为40岁以下。收集所有研究对象的临床资料,包括年龄、性别、血液透析时间、血压、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)等。结果：MHD患者与正常对照组比较,髂内动脉血管壁中膜厚度增加,中膜厚度/内径、中膜面积/内腔面积值均增大(P<0.05),钙化程度增加(P<0.05);在MHD患者不同年龄组间比较,40岁以上组比40岁以下组动脉血管壁中膜厚度增加,中膜厚度/内径值、中膜面积/内腔面积值均增大(P<0.05));血管壁中膜厚度与年龄、血压呈正相关(P<0.01);PAI-1,t-PA,ET-1在MHD患者髂内动脉管壁中较正常对照组的表达上调(P<0.05);PAI-1和ET-1在40岁以上组较40岁以下组的表达上调(P<0.05),t-PA在两组中的表达差异无统计学意义;PAI-1或ET-1的表达与年龄或血压呈正相关;t-PA的表达与年龄、血压无相关性(P>0.05)。PAI-1或ET-1的表达与中膜厚度或钙化程度呈正相关(P<0.05或P<0.01)。血液透析时间与血管壁中膜厚度、中膜厚度/内径、中膜面积/内腔面积值、钙化程度、PAI-1、t-PA以及ET-1的表达无相关性。结论：1)MHD患者存在动脉硬化;40岁以上的MHD患者动脉硬化程度较40岁以下者更为严重;且随着血压的增高,动脉硬化程度加重。2)PAI-1和ET-1的异常表达在MHD患者动脉硬化进程中起重要作用, t-PA在MHD患者动脉硬化进程中作用不明显。3)PAI-1或ET-1的表达与中膜厚度或钙化程度呈正相关,提示二者可能有助于临床上对MHD患者动脉硬化程度的判断。4)血液透析治疗时间可能不是加速动脉硬化的潜在因素。     

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目的 研究鼻咽癌中浸润的淋巴类细胞与癌细胞凋亡间的相关性。方法 收集中山医科大学病理学教研室     

锰超氧化物歧化酶基因TaqI多态性与精神分裂症有关联吗？

目的 探讨印度人群锰超氧化物歧化酶（ＭｎＳＯＤ／ＳＯＤ２）基因ＴａｑＩ多态性与精神分裂症的相互关系。方法 应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）。方法 在６８例精神分裂症患者和６２例健康人群中观察了ＳＯＤ２基因多态性的分布。     

临床输液反应诸因素分析及对策

输液反应是临床护士在治疗操作中常遇到的问题,我院内科病区在１９９８年共发生输液反应１７例。现将引起输液反应的一些因素分析如下。１临床资料我院内科病区１９９８年共发生输液反应１７例,其中男性９例,女性８例。给药途径：１２例经手背、足背静脉用一次性头皮针...