核仁素调控多药耐药基因MDR1参与胃癌顺铂耐药

目的:探讨核仁素(Nucleolin,NCL)与胃癌顺铂耐药的关系,为胃癌的耐药机制研究和治疗提供新的基因靶点。方法:通过Western blot检测胃癌细胞SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP中NCL的表达量;通过转染siRNA干扰NCL的表达量,MTT实验检测敲低NCL表达对胃癌细胞耐药性的影响;通过转染GFP-NCL真核表达质粒,过表达NCL并检测多药耐药基因MDR1的表达变化。结果:Western blot结果表明NCL在耐药细胞SGC7901/DDP中表达量明显升高;MTT实验结果表明,干扰NCL的表达后,胃癌细胞对顺铂DDP的敏感性明显增高;荧光显微镜显示GFP-NCL定位在核仁区域,Western blot显示,NCL过表达能够明显促进MDR1的表达。结论:核仁素NCL通过调控多药耐药基因MDR1的表达参与胃癌细胞顺铂耐药。     

RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的VEGF表达的影响

目的研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）特异性抑制剂RAD001对胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达的影响,以期为临床治疗肿瘤提供新的线索。方法常规培养胃癌耐药细胞株SGC7901／DDP,RAD001单独或联合顺铂（DDP）干预48h后,ELISA法测定药物对细胞分泌VEGF蛋白的影响,蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学法检测药物作用后细胞中VEGF蛋白的表达情况。结果RAD001单独或联合DDP干预后,SGC7901／DDP细胞分泌的VEGF蛋白减少,呈剂量依赖性;SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的表达降低。结论RAD001可以减少胃癌SGC7901／DDP细胞的VEGF蛋白的分泌和表达,与DDP联合用药时作用更明显。     

雷公藤甲素通过抑制microRNA-21的表达提高SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性

目的:观察雷公藤甲素对胃癌SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性的影响,并探讨其机制。方法:采用非毒性浓度雷公藤甲素作用于SGC7901/CDDP细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增长率;荧光定量PCR检测microRNA-21表达;蛋白质印迹法检测Bcl-2蛋白表达;AnnexinV/PI双标法检测细胞凋亡。将microRNA-21反义寡核苷酸转染SGC7901/CDDP细胞,观察其对细胞增长率、凋亡和Bcl-2表达的影响。采用小干扰RNA转染实验证明Bcl-2与胃癌耐药的关系。结果:非毒性浓度雷公藤甲素可提高SGC7901/CDDP细胞对顺铂敏感性,并且降低mi-croRNA-21的表达。microRNA-21反义寡核苷酸转染SGC7901/CDDP细胞后,降低Bcl-2表达,提高顺铂敏感性和顺铂诱导的细胞凋亡。小干扰RNA实验证明Bcl-2水平与SGC7901/CDDP细胞顺铂耐药有关。结论:雷公藤甲素通过降低microRNA-21的表达,抑制Bcl-2蛋白表达,促进顺铂诱导的细胞凋亡,从而提高胃癌SGC7901/CDDP细胞顺铂敏感性。     

miR-885-3p抑制胃癌细胞的增殖和迁移

目的探讨微小RNA miRNA-885-3p对胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法采用qRT-PCR检测miRNA-885-3p在4种胃癌细胞株（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS）以及人胃正常黏膜GES-1细胞中的表达。将mimic（miRNA-885-3p模拟物）或miRNA-NC转染SGC-7901细胞后,分为3组:miR-mimic组（mimic转染）、miR-NC组（miRNA-NC转染）、空白对照组（未经转染）,采用CCK-8检测各组SGC-7901细胞增殖情况,采用伤口愈合实验检测各组SGC-7901细胞迁移能力,采用transwell实验检测各组SGC-7901细胞侵袭能力。结果 miRNA-885-3p在SGC-7901、MGC-803、BGC-823、AGS胃癌细胞株中的表达显著低于在人胃正常黏膜GES-1细胞中的表达（P<0.05）,在miR-NC组、空白对照组SGC-7901细胞中的表达显著低于在miR-mimic组SGC-7901细胞中的表达（P<0.05）。miR-mimic组SGC-7901细胞活力、迁移距离及侵袭细胞数均显著低于空白对照组和miR-NC组（均P<0.05）。结论 miRNA-885-3p在胃癌细胞中低表达,其抑制胃癌细胞增殖和迁移,具有潜在的应用价值。     

miR-145通过IGF1R 与 IRS1逆转胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性

目的:研究miR-145对胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP顺铂耐药的影响?方法:应用QRT-PCR检测miR-145在胃癌组织?细胞中的表达水平;MTT法和细胞克隆形成实验检测细胞活性与增殖能力;荧光素酶实验验证miR-145的靶基因;Western blot?免疫组化和免疫荧光实验检测相关蛋白表达;流式细胞术检测耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响?结果:miR-145在胃癌组织?各种胃癌细胞株中呈低表达;在胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP中,miR-145呈低表达,IGF1R 与 IRS1呈高表达;上调miR-145增强SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶报告实验证实IGF1R 与 IRS1为miR-145的靶基因;上调miR-145显著降低靶蛋白表达,抑制SGC7901/DDP细胞增殖,促进顺铂诱导的凋亡?结论:上调miR-145通过靶向IGF1R 与 IRS1逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性?     

Src酪氨酸激酶抑制剂逆转人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的作用及机制

目的探讨Src酪氨酸激酶抑制剂逆转人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的作用及机制。方法以Src酪氨酸激酶抑制剂逆转前后的人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP为研究对象,应用Western blot观察细胞内p-Src表达的变化,MTS法检测细胞的药物敏感性,流式细胞仪检测细胞Rh123外排及P-gp表达的水平。结果 Src酪氨酸激酶抑制剂可下调SGC7901/DDP细胞中p-Src表达,在5μmol/L及10μmol/L Src酪氨酸激酶抑制剂作用下,SGC7901/DDP细胞对顺铂的药物敏感性分别提高了1.52倍和3.96倍,细胞中Rh123含量分别提高了1.24倍和2.64倍,P-gp表达水平分别降低了65.8%和47.4%。结论 Src酪氨酸激酶抑制剂可逆转SGC7901/DDP细胞多药耐药性,其耐药表型的逆转可能与降低细胞Rh123外排及P-gp表达水平有关。     

基于微流控芯片的CAFs影响胃癌细胞耐药及GRP-78表达相关性

目的:利用微流控芯片平台探索肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)影响人胃癌SGC7901细胞对化疗药物的耐药及其与GRP78表达的相关性,从而为临床工作提供以CAFs和GRP78为靶点来改善肿瘤耐药的新思路。方法:本实验自主设计了一个可用于药敏检测及蛋白半定量的三维联合共培养微流控芯片体系,通过灌注细胞悬液-凝胶混合物于三维培养池内来实现胃癌细胞系的三维培养。应用凋亡染色方法检测SGC7901细胞单独培养组(对照组)、SGC7901细胞+NFs共培养组、SGC7901细胞+CAFs共培养组中SGC7901细胞对不同浓度的化疗药物顺铂的药物敏感情况。应用免疫荧光法检测对照组和实验组SGC7901细胞GRP78表达。结果:SGC7901细胞+CAFs共培养组与单培养组相比,SGC7901细胞对顺铂的敏感性较SGC7901细胞单独培养时低(P0.05),SGC7901细胞+CAFs共培养组SGC7901细胞中GRP78蛋白表达较对照组升高(P0.05)。结论:CAFs可以诱导人胃癌SGC7901细胞对顺铂耐药;CAFs可能通过上调人胃癌SGC7901细胞中GRP78的表达而导致耐药。     

人参皂苷Rg3通过下调PD-L1逆转胃癌细胞的顺铂耐药性

目的 探究人参皂苷Rg3对顺铂（DDP）耐药性胃癌细胞株SGC7901/DDP的逆转作用及机制。方法 CKK-8法鉴定Rg3对SGC7901/DDP细胞的毒性,筛选出合适浓度进行实验;将SGC7901/DDP细胞分为5组,空白对照组、Rg3低剂量组（10μg/ml）、中剂量组（20μg/ml）、高剂量组（40μg/ml）、维拉帕米组（10μg/ml）,CCK-8法检测Rg3对SGC7901/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用;实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印记（WB）检测PD-L1mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测SGC7901/DDP细胞PD-L1过表达后,Rg3对细胞耐药性的作用。结果 5、10、20、40、80、160μg/ml Rg3均能抑制SGC7901、SGC7901/DDP细胞活性,呈剂量和时间依赖效应,选择5、10、20、40μg/ml作为人参皂苷Rg3实验浓度。与DPP组比较,Rg3处理后DDP对SGC7901/DDP细胞增殖的抑制作用明显增强（P<0.05）。与SGC7901细胞比较,SGC7901/DDP细胞中PD-L1蛋白显著高表达（P<0.05）;与DPP组比较,Rg3处理后细胞中PD-L1mRNA及蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。SGC7901/DDP细胞PD-L1过表达可有效减弱Rg3对SGC7901/DDP细胞耐药性的逆转作用。结论 人参皂苷Rg3可有效抑制SGC7901/DDP细胞增殖,增加SGC7901/DDP对顺铂的敏感度,其机制可能通过下调PD-L1基因表达实现。     

Pokemon基因表达与胃癌耐药性的关系

目的 探讨okemon基因表达与胃癌细胞药敏性及耐药基因的关系.方法 取60例胃癌组织和癌旁组织石蜡标本,采用免疫组化技术检测组织中pokemon蛋白及耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)、生存素(survivin)的表达,并分析pokemon蛋白与其他4种蛋白的关系.采用磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法检测5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(L-OHP)对胃癌细胞株SGC7901、胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR、胃上皮细胞株GES-1的抑制作用;qPCR及蛋白质印迹法检测上述3种细胞株中pokemon和耐药基因的表达.合成针对pokemon的siRNA并转染SGC7901/ADR细胞,检测转染前后SGC7901/ADR细胞的化疗药敏性及耐药基因的变化.结果 胃癌组织中pokemon、P-gp、MRP1、LRP、survivin蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织(P＜0.05);pokemon蛋白表达与P-gp、survivin蛋白表达间存在正相关关系(r=0.385 2,P=0.002;r=0.342 4,P=0.007).Pokemon、P-gp、MRP1、survivin蛋白在SGC7901/ADR细胞株中的表达高于细胞株SGC7901及GES-1;SGC7901/ADR细胞株的耐药性最强,SGC7901次之,GES-1最弱(P＜0.01).Pokemon-siRNA转染SGC7901/ADR细胞后细胞中pokemon mRNA的表达明显受到抑制;转染后化疗药物对细胞的抑制能力增强,P-gp、survivin表达减弱(P＜0.05).结论 Pokemon与P-gp、survivin通过相互调控而促进胃癌耐药性的形成.Pokemon可能成为胃癌靶向治疗的候选基因.     

癌蛋白CIP2A在胃癌顺铂耐药中的表达及机制研究

目的:本文旨在探讨蛋白磷酸酶2A (cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)在顺铂(cisplatin,DDP)耐药的胃癌细胞中的表达及机制。方法:实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blotting检测患者胃癌组织及细胞中CIP2A表达情况;CIP2A过表达质粒和siRNA分别转染SGC7901和SGC7901/DDP细胞,通过MTT法检测细胞对DDP的敏感性;流式细胞术用于检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR、Western blotting检测多药耐药相关蛋白的表达。结果:与DDP敏感型患者相比,CIP2A在DDP耐药胃癌患者中表达较高,而CIP2A高表达的DDP耐药胃癌患者的总体生存率低于CIP2A低表达的患者。在DDP耐药的胃癌细胞中敲低CIP2A能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并且也可以提高DDP耐药细胞对DDP的敏感性,反之,CIP2A过表达则导致DDP耐药细胞对DDP的敏感性降低,以上作用是通过CIP2A影响多药耐药相关蛋白在胃癌细胞中的表达实现的。结论:CIP2A在胃癌顺铂耐药的发生中发挥着关键作用,有望成为DDP耐药胃癌患者的一种新型治疗靶点。     

ALCAM基因1沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的 探讨活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并对其分子机制进行初步研究.方法 将ALCAM 和对照shRNA转染至胃癌细胞SGC-7901中,建立稳定细胞系,分别采用实时荧光定量(RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转染后SGC-7901细胞中ALCAM mRNA和蛋白水平;采用CCK-8法检测转染后SGC-7901细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测转染后SGC-7901细胞凋亡情况.采用胃癌肿瘤模型分析ALCAM基因沉默对肿瘤生长的影响.结果 ALCAM shRNA稳定细胞系ALCAM mRNA(1.01 ±0.26)和蛋白质的表达水平(1.66 ±0.23)低于对照 shRNA组细胞ALCAM mRNA(0.12 ±0.06)和蛋白质水平(0.23 ±0.09),差异有统计学意义(P<0.05).与对照shRNA稳定细胞系比较,ALCAM shRNA 稳定细胞系细胞增殖活性下降(P<0.05)、凋亡水平升高(P<0.05)、荷瘤小鼠肿瘤生长速度减缓(P<0.05).ALCAM下调并不影响总蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,而降低了AKT和mTOR磷酸化水平,抑制了mTOR活性,此外,ALCAM蛋白敲低提高了Caspase-3蛋白的表达水平,激活了凋亡信号通路.结论 ALCAM基因沉默能够降低胃癌细胞中ALCAM的表达水平,抑制胃癌细胞的增殖,增加细胞凋亡.     

miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌生物学行为的影响

目的:探讨miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达情况及对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:应用实时荧光定量PCR法分析31例胃癌组织和癌旁组织样本以及人胃癌细胞系SGC-7901、MKN45、人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miRNA-101的表达水平;建立miRNA-101重组腺病毒载体感染胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,对照组为感染阴性对照病毒的胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,MTT法检测miRNA-101对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室法检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力.结果:胃癌组织中miR-101表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01);miR-101在细胞系SGC-7901和MKN45中的表达量明显低于人正常胃黏膜上皮细胞系GES1(P<0.01).孵育48 h后MKN45细胞miRNA-101组的细胞增殖能力低于其对照组(P<0.05);而孵育72 h后SGC-7901细胞和MKN45细胞的miRNA-101组细胞增殖能力均亦低于相应对照组(P<0.05).迁移试验结果显示,miRNA-101组迁移的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数明显低于相应对照组(P<0.01);侵袭实验结果显示,miRNA-101组侵袭的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数亦明显低于其对照组(P<0.01).结论:miRNA-101在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调,转染miRNA-101可明显降低SGC-7901和MKN45细胞的增殖、迁移、侵袭能力,miRNA-101可能参与了胃癌疾病的发生及发展.     

RN Ai对胃癌SGC-7901细胞侵袭及迁移能力的影响

目的：运用RNA干扰（RNAi）技术抑制HER2基因的表达,探讨其对胃癌SGC‐7901细胞侵袭及迁移能力的影响。方法设计、构建RNAi片段靶向抑制HER2高表达的胃癌细胞株（HER2‐RNAi组）,以转染阴性对照系列（阴性对照组）及未转染的SGC‐7901细胞（空白对照组）为对照组。利用RT‐PCR和Western blot法检测各组胃癌SGC‐7901细胞中 HER2的表达情况;采用Transwell小室模型及划痕实验检测RNAi对胃癌细胞体外的侵袭和迁移能力的影响。结果 RNAi片段转染后SGC‐7901细胞的HER2 mRNA和蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）;侵袭实验结果显示,HER2‐RNAi组的穿膜细胞数[（31．5±3．8）个／视野]显著低于未转染组[（103．6±4．5）个／视野];迁移实验结果显示,HER2‐RNAi组的穿膜细胞数[（63．6±5．1）个／视野]显著低于未转染组[（193．5±6．2）个／视野],各组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 RNAi沉默 HER2基因可以抑制胃癌SGC‐7901细胞的侵袭和迁移能力,提示RNAi基因沉默技术有可能成为进展期胃癌治疗的新方法。     

URI在胃癌组织的表达及对顺铂诱导的胃癌细胞凋亡的影响

目的: 探讨癌蛋白非经典前折叠素RPB5相互作用因子(unconventional prefoldin RPB5 interactor, URI)     

人层粘连蛋白受体调节胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的：探讨相对分子质量为67000的人层粘连蛋白受体（LR）对胃癌细胞多药耐药性（MDR）的调节作用及其机制。方法：应用DNA重组技术构建LR前体蛋白（LRP）的反义RNA表达载体,并借助脂质体将其导入胃癌MDR细胞SGC7901／VCR中。用Western印迹法检测ＬＲ在胃癌细胞中的表达,ＭＴＴ法测定细胞对化疗药物的敏感性,流式细胞仪测定细胞周期以及阿霉素在细胞内的蓄积和潴留。结果：转染LRP反义RNA表达载体显著降低了LR在SGC7901／VCR细胞中的表达。转染细胞（SGC7901／VCR－anLRP)对长春新碱、阿霉素、5－氟尿嘧啶和顺铂的敏感性明显升高,细胞内蓄积和潴留的阿霉素也明显增多。细胞周期分析表明,SGC7901／VCR－anLRP细胞发生了G1期阻滞,并出现了自发性凋亡。结论：LR可能通过影响药物蓄积和细胞凋亡参与对胃癌细胞MDR的调节。     

Hsa-mir-216a真核表达载体的构建及其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达

目的:构建人mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础.方法:依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列设计引物;PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至pGenesil-1载体;将pGenesil-1-hsa-mir-...     

应用siRNA技术下调survivin基因表达以增强SGC7901胃癌细胞对顺铂的敏感性

目的利用小干扰RNA（siRNA）技术特异性下调survivin基因的表达,检测SGC7901胃癌细胞转染前后对顺铂敏感性的变化。方法实验分为空白对照组（control组）、单用顺铂组（CDDP组）、脂质体组（Lip组）、单用survivin siRNA组（siRNA组）、转染survivin siRNA（转染组）及转染survivin siRNA联合顺铂作用组（联合作用组）。人工合成survivin siRNA,通过Lip包裹将siRNA转染胃癌细胞SGC7901,荧光显微镜下观察转染情况。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,Western blot及免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态改变。结果Hoechst染色荧光显微镜下control组、Lip组及siRNA组细胞核呈正常的蓝色,而CDDP组、转染组及联合作用组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;联合作用组细胞增殖抑制率（63.93±4.22）%明显高于其余各组（P〈0.05）;转染组及联合作用组survivin蛋白表达明显低于其他各组（P〈0.05）。结论应用siRNA技术下调SGC7901胃癌细胞中survivin基因的表达,能够增加其对顺铂的药物敏感性。     

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达影响实验研究

目的 观察应用SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响并对其机制进行初步研究。方法 常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ干预及DDP干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况;免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用对Sphk1、VEGF表达的影响。结果 MTT检测SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及western-blot检测显示SKI-II作用后可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用。结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和Sphk1蛋白表达而有效抑胃癌SGC7901细胞增殖。