HIF-1α在RAD001联合DDP下调胃癌SGC7901/DDP细胞株VEGF分泌中的作用

目的 研究缺氧诱导因子（HIF-1α）在mTOR特异性抑制剂RAD001联合DDP下调胃癌细胞株SGC7901/DDP VEGF表达中的作用,并探讨其相关作用机制.方法 体外培养胃癌SGC7901/DDP细胞株,分别给予RAD001、DDP及RAD001＋DDP干预48 h后,免疫细胞化学染色及Western-blot法检测HIF-1α、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达情况,RT-PCR法检测HIF-1α mRNA、VEGF mRNA的合成情况.结果 RAD001单独作用于SGC7901/DDP细胞48 h后,HIF-1α、VEGF蛋白的表达和HIF-1α 、VEGF mRNA的合成下降,且呈剂量依赖性.联合用药组比单独用药组作用增强,差异有统计学意义（P〈0.05）.VEGF和HIF-1α蛋白呈正相关（r=0.993,P〈0.01）,HIF-1α mRNA和VEGF mRNA呈正相关（r=0.994,P〈0.01）.结论 RAD001能够抑制细胞体外VEGF、HIF-1α的蛋白表达及mRNA的合成,RAD001联合DDP作用后,效果增强,其机制可能与mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路有关.     

RAD001对胃癌SGC7901细胞生长的抑制作用及分子机制

目的:研究mTOR特异性抑制剂RAD001对胃癌SGC7901细胞增殖的影响,并探讨survivin在其中的作用.方法:常规培养胃癌SGC7901细胞,RAD001单独或联合顺铂干预,MTT法测定RAD001对胃癌SGC7901细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率.免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用...     

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达影响实验研究

目的 观察应用SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响并对其机制进行初步研究。方法 常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ干预及DDP干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况;免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用对Sphk1、VEGF表达的影响。结果 MTT检测SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及western-blot检测显示SKI-II作用后可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用。结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和Sphk1蛋白表达而有效抑胃癌SGC7901细胞增殖。     

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,并对其机制进行初步研究.方法 常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ及顺铂(DDP)干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况,免疫组化和Western blot检测药物对SphK1、VEGF表达的影响.结果 MTT检测显示SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及Western blot检测显示SKI-Ⅱ可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用.结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和SphK1蛋白表达而有效抑制胃癌SGC7901细胞增殖.     

依维莫司联合顺铂对人胃癌SGC7901细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响

目的探讨依维莫司(RAD001)联合顺铂对人胃癌SGC7901细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响。方法体外培养SGC7901细胞,将其分为对照组,顺铂组(顺铂2.50 mg/L),RAD001低浓度组(RAD001 5.00nmol/L)、RAD001中浓度组(RAD001 10.00nmol/L)、RAD001高浓度组(RAD001 20.00nmol/L)及联合组(顺铂1.25mg/L+RAD001 5.00nmol/L),采用流式细胞术检测SGC7901细胞的凋亡率,采用免疫细胞化学、Western blot检测SGC7901细胞Bcl-2和Bax的表达情况。结果 RAD001、顺铂作用SGC7901细胞48h后,对照组,顺铂组,RAD001低、中、高浓度组及联合组的细胞凋亡率分别为(8.04±0.48)%、(18.94±0.75)%、(10.47±1.05)%、(13.93±2.45)%、(17.20±0.65)%及(23.18±1.05)%。除RAD001低浓度组细胞凋亡率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),其他各组细胞凋亡率均较对照组显著增加(P<0.05)。与对照组比较,顺铂组、RAD001组及联合组SGC7901细胞Bcl-2蛋白表达下降,而Bax蛋白表达增加,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05),联合组改变最明显。结论 RAD001联合顺铂可通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白的表达诱导SGC7901细胞凋亡。     

依维莫司联合顺铂对胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白特异性抑制剂依维莫司（everolimus,RAD001）对胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响、作用机制及其联合顺铂对SGC7901细胞抑制是否具有协同作用。方法体外培养SGC7901细胞,依维莫司单独及联合顺铂作用后,通过HE染色检测各组SGC7901细胞的形态学改变;流式细胞术检...     

miR-145通过IGF1R 与 IRS1逆转胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性

目的:研究miR-145对胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP顺铂耐药的影响?方法:应用QRT-PCR检测miR-145在胃癌组织?细胞中的表达水平;MTT法和细胞克隆形成实验检测细胞活性与增殖能力;荧光素酶实验验证miR-145的靶基因;Western blot?免疫组化和免疫荧光实验检测相关蛋白表达;流式细胞术检测耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响?结果:miR-145在胃癌组织?各种胃癌细胞株中呈低表达;在胃癌耐顺铂细胞株SGC7901/DDP中,miR-145呈低表达,IGF1R 与 IRS1呈高表达;上调miR-145增强SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶报告实验证实IGF1R 与 IRS1为miR-145的靶基因;上调miR-145显著降低靶蛋白表达,抑制SGC7901/DDP细胞增殖,促进顺铂诱导的凋亡?结论:上调miR-145通过靶向IGF1R 与 IRS1逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性?     

Pokemon基因表达与胃癌耐药性的关系

目的 探讨okemon基因表达与胃癌细胞药敏性及耐药基因的关系.方法 取60例胃癌组织和癌旁组织石蜡标本,采用免疫组化技术检测组织中pokemon蛋白及耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)、生存素(survivin)的表达,并分析pokemon蛋白与其他4种蛋白的关系.采用磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法检测5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)、奥沙利铂(L-OHP)对胃癌细胞株SGC7901、胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR、胃上皮细胞株GES-1的抑制作用;qPCR及蛋白质印迹法检测上述3种细胞株中pokemon和耐药基因的表达.合成针对pokemon的siRNA并转染SGC7901/ADR细胞,检测转染前后SGC7901/ADR细胞的化疗药敏性及耐药基因的变化.结果 胃癌组织中pokemon、P-gp、MRP1、LRP、survivin蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织(P＜0.05);pokemon蛋白表达与P-gp、survivin蛋白表达间存在正相关关系(r=0.385 2,P=0.002;r=0.342 4,P=0.007).Pokemon、P-gp、MRP1、survivin蛋白在SGC7901/ADR细胞株中的表达高于细胞株SGC7901及GES-1;SGC7901/ADR细胞株的耐药性最强,SGC7901次之,GES-1最弱(P＜0.01).Pokemon-siRNA转染SGC7901/ADR细胞后细胞中pokemon mRNA的表达明显受到抑制;转染后化疗药物对细胞的抑制能力增强,P-gp、survivin表达减弱(P＜0.05).结论 Pokemon与P-gp、survivin通过相互调控而促进胃癌耐药性的形成.Pokemon可能成为胃癌靶向治疗的候选基因.     

Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药的关系

目的：应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关的蛋白质。方法：以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901／VCR为研究对象，应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）技术分离两种细胞的总蛋白，图像分析识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及电喷雾串联质谱（ESI-Q-TOF）对差异表达的蛋白质点进行鉴定。Western blot验证差异蛋白质的表达水平，反义核酸技术分析差异蛋白与胃癌耐药的关系。结果：可溶性耐药相关性钙结合蛋白（sorcin）在SGC7901／VCR细胞中高表达，反义核酸抑制sorcin表达可增强SGC7901／VCR对长春新碱的化疗敏感性。结论：Sorcin蛋白质高表达与胃癌细胞多药耐药密切相关。     

胃癌耐药细胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表达及对细胞多药耐药性的影响

目的 检测miR-185在胃癌组织及细胞株中的表达,探讨miR-185在胃癌多药耐药性（MDR）发生机制中的作用。方法 选取2014年3-5月于河北医科大学第四医院行胃癌切除术的20例患者胃癌及癌旁组织标本,荧光定量PCR技术检测胃癌及癌旁组织和人胃腺癌细胞株SGC7901、正常胃上皮细胞株GES-1、耐阿霉素（ADR）的胃癌MDR细胞株SGC7901/ADR的miR-185表达水平。采用miR-185模拟物或无关对照序列转染细胞株SGC7901/ADR,检测其对化疗药物ADR、5-氟尿嘧啶（5-FU）、草酸铂（L-OHP）的敏感性,荧光定量PCR和Western blotting技术检测多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP的mRNA及蛋白表达水平。结果 癌旁组织和胃癌组织miR-185相对表达水平分别为（0.910±0.142）、（0.243±0.045）,差异有统计学意义（t=20.025,P＜0.001）。细胞株GES-1、SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平分别为（0.903±0.117）、（0.630±0.101）和（0.191±0.030）,差异有统计学意义（F=46.850,P＜0.001）。其中,细胞株SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于GES-1,细胞株SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于SGC7901（P＜0.05）。ADR、5-FU和L-OHP对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR抑制率比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中,ADR、5-FU和L-OHP对miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR抑制率高于未转染和无关对照序列转染（P＜0.05）。经不同转染处理后,细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA和蛋白相对表达水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。其中,miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA和蛋白相对表达水平低于未转染和无关对照序列转染（P＜0.05）。结论 胃癌细胞miR-185表达下调,通过上调miR-185的表达可提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能是miR-185调控部分多药耐药基因的表达。     

Src酪氨酸激酶抑制剂逆转人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的作用及机制

目的探讨Src酪氨酸激酶抑制剂逆转人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的作用及机制。方法以Src酪氨酸激酶抑制剂逆转前后的人胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP为研究对象,应用Western blot观察细胞内p-Src表达的变化,MTS法检测细胞的药物敏感性,流式细胞仪检测细胞Rh123外排及P-gp表达的水平。结果 Src酪氨酸激酶抑制剂可下调SGC7901/DDP细胞中p-Src表达,在5μmol/L及10μmol/L Src酪氨酸激酶抑制剂作用下,SGC7901/DDP细胞对顺铂的药物敏感性分别提高了1.52倍和3.96倍,细胞中Rh123含量分别提高了1.24倍和2.64倍,P-gp表达水平分别降低了65.8%和47.4%。结论 Src酪氨酸激酶抑制剂可逆转SGC7901/DDP细胞多药耐药性,其耐药表型的逆转可能与降低细胞Rh123外排及P-gp表达水平有关。     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1对缺氧诱导因子-1转录活性调节机制的研究

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)参与缺氧诱导因子-1(HIF-1)转录活性调节的机制。方法采用Western印迹检测常氧及缺氧状态下磷酸化细胞外信号调节激酶ERK和总ERK在胃癌细胞系SGC7901中的表达;利用脂质体将正义真核表达载体及针对MKP-1的小干扰RNA载体转入SGC901细胞;借助双荧光素酶基因报告系统(dual luciferase reporter,DLR)检测ERK通路抑制剂PD98059对SGC7901细胞中HIF-1转录活性的影响。结果(1)缺氧时磷酸化ERK在SGC901中的含量增加,而总ERK的表达不变;(2)缺氧12h时不同浓度的PD98059均能抑制HIF-1的转录活性;而p38通路抑制剂SB203580对HIF-1的转录活性无影响;(3)将针对MKP-1的小干扰RNA载体和空载体分别瞬时转入SGC7901细胞,转染24h后,缺氧12h时磷酸化ERK在小干扰。RNA载体转染细胞(U6M2)的表达高于空载体转染细胞(U6);(4)不同浓度的PD98059均能够抑制U6和U6M2细胞中HIF-1的转录活性,当PD98059浓度达50μmol／L以上时,U6和U6M2细胞中HIF-1的转录活性差异无统计学意义。(5)不同浓度的PD98059均能够抑制U6和U6M2细胞血管内皮生长因子(VEGF)的产生,当PD98059浓度达50μmol／L以上时,VEGF的分泌量在U6和U6M2细胞中差异无统计学意义。结论在胃癌细胞系SGC7901中,缺氧时MKP-1通过灭活ERK的途径参与HIF-1转录活性的调节。     

分化抑制因子1在环氧合酶2介导的胃癌血管生成中的作用及机制研究

目的验证分化抑制因子1（Id-1）在环氧合酶2（COX-2）介导的胃癌血管生成中的作用及机制。方法建立高表达COX-2和表达COX-2特异性siRNA的胃癌SGC7901细胞,通过Western印迹和逆转录PCR方法检测两种亚细胞系中Id1的表达,ELISA方法分析两种细胞上清中血管内皮生长因子（VEGF）的表达差异。通过四唑盐比色（MTT）实验分析两种细胞亚系的上清对体外脐静脉内皮细胞（HU-LT）增殖的影响,并在SGC7901／COX-2中抑制Id1后观察培养上清中VEGF的变化以及对脐静脉内皮细胞（HU-LT）增殖的影响。裸鼠成瘤实验观察转染细胞的成瘤性及肿瘤新生微血管密度（MVD）。结果成功建立高表达COX-2以及表达特异性COX-2小干扰RNA（siRNA）的稳定克隆,并鉴定了不同克隆的转染效率。高表达COX-2的胃癌SGC7901细胞中Id1的蛋白及mRNA表达水平增高,而转染COX-2-siRNA的SGC7901细胞中Id1的表达则均低于对照组。COX-2高表达的SGC7901／COX-2细胞上清中VEGF的蛋白含量高于对照组（2060±42 vs 1248±28,P=0．000）,而SGC7901／COX-2-siRNA细胞上清中VEGF的蛋白含量低于对照组（1024±20,2033±27vsP=0．000）。在SGC7901／COX-2细胞条件培养基中,HU-LT细胞生长较对照组快;在SGC7901／COX-2-SiRNA细胞条件培养基中,HU-LT细胞生长较对照组缓。在SGC7901／COX-2中抑制Id1后,培养上清中VEGF的含量增加以及对HU-LT促进增殖的作用均被逆转。裸鼠成瘤试验显示抑制Id1后SGC／901／COX-2细胞成瘤性降低[（353±12）mg vs（1020±91）mg,P=0．038],MVD降低（8．8±1．6vs20±1．7,P=0．001）。结论COX-2可以上调SGC7901细胞中Id1的表达,并通过此途径影响内皮细胞的体外增殖能力。因此在胃癌发生发展中Id1参与了COX-2所介导的促血管生成过程,有可能成为胃癌抗血管治疗的新靶标。     

miRNA-21-5p通过pdcd4靶向调控胃癌细胞对顺铂敏感性的机制研究

目的:探究微小RNA-21-5p（miRNA-21-5p）通过下调pdcd4基因表达调控胃癌耐药细胞系SGC-7901/DDP对顺铂敏感性机制的研究。方法:采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度的顺铂（0、1、2、4、8、16、32 μmol/L）对胃癌细胞系SGC7901及胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP增殖抑制的影响。通过实时荧光定量PCR检测SGC7901/DDP细胞中瞬时转染miRNA-21-5p inhibitors后miRNA-21-5p相对表达量的变化。采用Western blot及实时荧光定量PCR检测转染组、无关序列转染组（NC组）及空白转染组（CON组）分别转染miRNA-21-5p inhibitors及无关序列后对靶基因pdcd4蛋白及mRNA表达量的影响。结果:MTT实验结果显示耐药细胞SGC7901/DDP相对于亲本细胞SGC7901对顺铂不敏感（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果表明,转染组miRNA-21-5p表达量均明显低于NC组和CON组（P<0.01）,转染组pdcd4 mRNA表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。Western blot检测结果示,转染组pdcd4蛋白表达量均明显高于NC组和CON组（P<0.01）。结论:miRNA-21-5p表达水平的升高在一定程度上有利于胃癌细胞增殖,并通过下调pdcd4的表达,降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。     

Hsa-mir-216a真核表达载体的构建及其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达

目的:构建人mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901/DDP中的表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础.方法:依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列设计引物;PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至pGenesil-1载体;将pGenesil-1-hsa-mir-...