人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞,探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用,为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径.方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌,抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶Xho I,Not I酶切,琼脂糖凝胶电泳得到755 bp大小的目的条带.紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因,用Xho I,NotI酶切PCDNA3.1质粒载体并在相同位点插入FasL基因,T4酶连接,构建PCDNA3.1-FasL重组质粒.脂质体转染法将PCDNA3.1-FasL基因转染Hela细胞,G418筛选;经过免疫细胞化学法,RT-PCR鉴定后,进行单项淋巴细胞混合试验,检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用.结果表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调,仅达到对照组刺激指数的17.01%.结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡,为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想.     

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体.方法:通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1( )连接,构建PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体.结果:经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功.结论:成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础.     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。     

紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2表达载体的构建

目的：为进一步研究紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2在结肠直肠癌中的作用,分别构建包含claudin-1和claudin-2基因编码区的重组质粒,并在人类结肠癌细胞株T84中表达。方法：从T84细胞中提取总RNA,反转录PCR获得cDNA,插入pCRⅡ-TOPO质粒中测序鉴定。将测序正确的cDNA连接入pcDNA3.1（-）表达载体,进一步测序鉴定后转染入T84细胞,并采用反转录荧光定量实时PCR技术及Western blot技术检测重组质粒在T84细胞中的表达。结果：重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示所克隆的DNA分子大小及序列正确。经重组质粒转染的T84细胞能大量稳定地表达目标蛋白。结论：本研究成功地构建了claudin-1/pcDNA3.1（-）和claudin-2/pcDNA3.1（-）重组表达质粒,并能在结肠癌细胞中稳定表达。     

褪黑素被动免疫对前列腺增生模型鼠生殖内分泌的影响

目的：探讨褪黑素（Mlt)与前列腺增生模型鼠生殖内分泌的关系。方法：按照一定的浓度梯度静脉注射Mlt抗血清，60d后采集模型鼠血清，用放射免疫测定法测定模型鼠的睾酮（T）含量与促黄体素（LH）含量。结果：前列腺增生模型鼠组LH与T含量均低于对照组。结论：Mlt与前列腺增生可能相关。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

Pim-3质粒构建体在大鼠活体肝组织的表达和活性的研究

目的 构建大鼠Pim-3绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒并观察其在活体肝组织的表达和活性。方法采用逆转录-PCR的方法获取目的cDNA,重组质粒经酶切鉴定和测序;大鼠活体基因肝靶向性转染通过尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导采用腹腔内注射内毒素和D-半乳糖胺（D-GaIN）来实现。动物分为A、B、C和D组（即正常、对照、空质粒和重组质粒组,每组8只）;肝组织GFP表达通过荧光显微镜、Pim-3表达通过逆转录（RT）-PCR方法检测;肝细胞凋亡采用缺口末端标记技术（TUNEL）分析和半胱天冬酶-3活性检测。结果成功构建GFP表达质粒pEGFP-N2／Pim-3;重组质粒和空质粒DNA通过流体力学注射法被成功转染人大鼠活体肝组织内;4组Pim-3的相对表达水平分别为0．06±0．02、0、0、0．49±0．15。D组与其他3组差异均有统计学意义（均P〈0．01）;4组肝细胞的凋亡指数（AI）分别为：（3．1±0．7）％,（72．5±6．1）％、（69．8±5．7）％和（4．9±1．2）％;肝组织半胱天冬酶-3活性分别为（60±15）、（147±55）、（142±50）和（76±27）pmol·min ·mg^-1,D组与B、C两组间差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论 构建的重组体质粒pEGFP-N2／Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。     

重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对局灶性脑缺血大鼠脑保护作用的研究

目的 研究重组神经球蛋白表达质粒pCDNA3.1( )/Ngb对缺血中的脑保护作用.方法 54只雄性大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、空质粒组和重组神经球蛋白组,每组18只分别于皮质区两部位注射生理盐水、质粒pCDNA3.1( )和重组质粒pCDNA3.1( )/Ngb,并于注射后24 h采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血24 h模型.采用TTC染色、原位细胞凋亡检测、间接免疫荧光法和Western blot检测各组大鼠脑梗死面积,神经细胞凋亡状况和bcl-2蛋白表达变化.结果 经重组质粒pCDNA3.1( )/Ngb处理的大鼠,其脑梗死面积和注射处缺血半暗带凋亡细胞数较其他两组显著减少(P＜0.01),注射处缺血半暗带bcl-2阳性细胞面积百分比显著增高(P＜0.01),bcl-2蛋白的表达上升约40%～50%.结论 质粒pCDNA3.1( )介导大鼠神经球蛋白基因转入脑内可通过上调bcl-2蛋白表达抑制局灶性脑缺血神经细胞凋亡,起到局灶性脑缺血脑保护作用.     

抗肿瘤血管生成VEGFR2 DNA疫苗的构建

目的 构建一种新的抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4）．方法 采用RT-PCR技术，从BALB／c胎鼠组织中扩增出鼠血管内皮生长因子受体flk-1胞外区1-4个袢的cDNA片段，并将其插入真核表达载体质粒pcDNA3．1＋中，构建成重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），经DNA序列分析证实后，将重组质粒经脂质体法转染真核表达系统COS-7细胞，通过Western blot实验检测重组质粒在真核表达系统COS一7细胞中蛋白的表达．结果 RT-PCR扩增产物为1248bp大小的基因片段，经过DNA序列分析证明与GeneBank所公布的flk-1胞外区1-4结构域碱基一致，成功构建了重组质粒pcDNA3．1＋／ilk-1（nl-4），并且该重组质粒在真核表达系统COS-7细胞中成功得到表达．结论 成功地制备了抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），为进一步开展有关抗肿瘤血管生成的动物实验和临床应用奠定了基础。     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

反义转化生长因子βI型受体表达质粒对实验性肝纤维化的影响

目的 观察反主转化生长因子βI型受体（TβRI）表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法 运用重组DNA技术构建反义TβRI真核细胞表达质粒,经与糖化多聚赖氨酸偶联后,采用尾静脉注射将其导入猪血清诱导的免疫性大鼠肝纤维化模型体内;通过Northern印迹、RT－PCR、Western印迹及免疫组化等方法检测外源导入质粒在肝组织中的表达,并通过检测血清TGFβ1浓度以及肝组织羟脯氨酸测定,I、Ⅲ型胶原免疫组化与Van Gieson染色观察反义TβRI质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果 反义TβRI表达质粒可在肝组织中获得确切表达,其表达可抑制TGFβ1表达（P＜0．05）,降低羟脯氨酸含量（P＜0．01）,减少I、Ⅲ型胶原的沉积（P＜0．01）,并促进肝脏病理形态一定程度的改善（P＜0．01）。结论 反义TβRI表达质粒对肝纤维化有较好的改善作用。     

侧脑室微量注射GnIH对OEP大鼠血浆GnRH、LH水平的影响

目的：：观察侧脑室注射促性腺激素抑制激素(GnIH）对OEP大鼠血浆促性腺激素释放激素(GnRH）和黄体生成素(LH）水平的影响。方法：健康成年雌性SD大鼠40只,均建立卵巢摘除兼予雌激素注射(OEP）模型。随机分为GnIH实验组和生理盐水对照组,每组20只,大鼠分别给予侧脑室注射GnIH(5μl）和同等剂量生理盐水。采用ELISA法检测注射后1h、2h、4h、6h(n=5）大鼠血浆GnRH和LH的水平。结果：与对照组相比,注射GnIH 1h、6h GnRH、LH水平无明显变化(P＞0.05）;注射GnIH 2h、4h GnRH、LH水平明显降低(P＜0.05）。结论：侧脑室注射GnIH可影响OEP大鼠血浆GnRH和LH的水平,且影响作用与时间有关。     

大鼠辣椒素受体的重组

目的 构建辣椒素受体（vanilloid receptor1，VR1）真核表达载体，用以研究VR1的功能。方法 从大鼠的背根神经节中提取总RNA，逆转录为cDNA，以此为模板，用VR1特异性的引物扩增，随后将PCR产物插入T-easy载体，经酶切鉴定和测序，与GenBank序列比对。再将正确序列亚克隆至表达载体pEGFP-C3并鉴定。运用脂质体转染的方法，将构建好的表达载体pEGFP-C3-VR1转染到人胚胎肾细胞（HEK-293）中，用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的表达，通过免疫组化的方法确定目的蛋白VR1的表达。结果 克隆的大鼠VR1核苷酸序列与GenBank公布的序列AB040873和AF029310的编码区同源性分别达到99.92%和99.84%。转染24h后，绿色荧光蛋白和VR1均表达。结论 重组的VR1真核表达载体构建基本正确，并在HEK-293细胞中成功表达，为进一步研究其功能作了准备。