小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

血管内皮细胞生长因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建特异性的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因siRNA真核细胞表达载体，为探索RNA干扰（RNM）分子靶向治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的作用奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的VEGF基因核苷酸序列，按照Keynolds设计原则，针对VEGF的序列及二级结构选择靶序列，设计双链小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs，shRNA）的DNA序列，并与pRNAi-H1质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体pRNAi-H1VEGF siRNA，经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序进行鉴定。结果构建针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序证实与设计完全一致。结论针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体构建成功。     

紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2表达载体的构建

目的：为进一步研究紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2在结肠直肠癌中的作用,分别构建包含claudin-1和claudin-2基因编码区的重组质粒,并在人类结肠癌细胞株T84中表达。方法：从T84细胞中提取总RNA,反转录PCR获得cDNA,插入pCRⅡ-TOPO质粒中测序鉴定。将测序正确的cDNA连接入pcDNA3.1（-）表达载体,进一步测序鉴定后转染入T84细胞,并采用反转录荧光定量实时PCR技术及Western blot技术检测重组质粒在T84细胞中的表达。结果：重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示所克隆的DNA分子大小及序列正确。经重组质粒转染的T84细胞能大量稳定地表达目标蛋白。结论：本研究成功地构建了claudin-1/pcDNA3.1（-）和claudin-2/pcDNA3.1（-）重组表达质粒,并能在结肠癌细胞中稳定表达。     

抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.     

针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装

目的 针对NM_001025250.3,NM_001025257.3,NM_009505.4,构建4个针对靶基因小鼠VEGFA(血管内皮生长因子A)的小干扰RNA(siRNA)干扰载体,并将其重组转成慢病毒载体.方法 根据靶基因设计并合成4对siRNA干抚序列,将siRNA干扰序列克隆到pcDNA6.2-GW/EmGF...     

核基质蛋白SAFB真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建人SAFB基因真核表达载体,为SAFB基因功能研究提供研究基础。方法设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RT-PCR方法提取人SAFBcDNA,通过双酶切及测序鉴定,将SAFB克隆至pcDNA3.1（-）,构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SAFB,转染SW480细胞,用WesternBlot技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增人SAFB全长cDNA,双酶切鉴定和测序结果证实成功构建pcDNA3.1（-）/SAFB真核表达载体,转染细胞后,可检测出分子量约为140KD的目的蛋白。结论获得人SAFB基因全长cDNA并成功构建了SAFB真核表达载体,证实pcDNA3.1（-）/SAFB转染SW480细胞后可表达SAFB蛋白,为深入研究SAFB基因在肿瘤发生发展中的作用提供了基础。     

小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体的构建

目的构建小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达。方法从前期构建的原核表达载体PET-32a-CD25胞外段上酶切下CD25胞外段;将其亚克隆入真核表达载体peDNA3．1,并进行酶切及测序鉴定;用Lipofeetamine2000将pcDNA3．1-CD25胞外段转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary,crio）进行表达,并用ELISA法对表达产物进行测定。结果酶切、测序验证成功构建真核表达载体pcDNA3．1-CD25e,并在CHO细胞中有效表达CD25e蛋白。结论成功构建小鼠CD25胞外段的真核表达载体,可在CH10细胞中表达,并具有良好的免疫反应性,为后续实验提供了前期基础。     

mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

乙酰胆碱受体α1亚基真核表达载体的构建

目的：构建含人乙酰胆碱受体（AChR）α1亚基N末端主要免疫区205个氨基酸（AChRα205）编码基因的真核表达载体。方法：以pMARα205为模板PCR扩增AChRα205。酶切后将PCR产物插入到载体pcDNA3.1（＋）的EcoRⅠ、XhoⅠ位点之间,重组子经转化E.coliDH5α菌、筛选、酶切并测序进行鉴定。结果：用PCR方法从pMARα205中扩增出了约644bp的片段,构建的重组质粒经双酶切可得到约633bp的片段,大小与预期结果相符,测序表明序列正确。结论：用基因重组方法获得了含正确目的基因序列的重组质粒pcDNA3.1（＋）/AChRα205。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。